大黄牡丹汤含药血清对小鼠骨髓源巨噬细胞吞噬功能及Toll样受体mRNA表达的影响

苗大兴 肖天保 梁宛伶

(贵阳中医学院第一附属医院肛肠病医院，贵州 贵阳 550002)

大黄牡丹汤含药血清对小鼠骨髓源巨噬细胞吞噬功能及Toll样受体mRNA表达的影响

苗大兴 肖天保 梁宛伶

(贵阳中医学院第一附属医院肛肠病医院，贵州 贵阳 550002)

目的 观察大黄牡丹汤含药血清对小鼠骨髓源巨噬细胞(Mφ)吞噬活性和Toll样受体(TLRs)表达的影响。方法 常规制备大黄牡丹汤水煎剂，分大、中、小剂量灌胃干预清洁级SD大鼠，收集含药血清。采集小鼠骨髓细胞经M-CSF诱导培养Mφ，流式细胞仪检测细胞纯度。在96孔板中，用含药血清干预骨髓源Mφ一定时间后，中性红法检测Mφ吞噬活性；RT-PCR法检测TLR-1～5 mRNA的表达。结果 流式细胞仪检测显示，诱导培养小鼠骨髓源Mφ纯度超过90%。与正常对照组比较，各剂量给药组含药血清干预Mφ的吞噬功能明显增强(P<0.05或P<0.01)；大剂量给药组含药血清干预Mφ的TLR-3、各剂量给药组含药血清干预Mφ的TLR-4和TLR-5的mRNA表达量明显增强(P<0.05或P<0.01)，大、小剂量给药组含药血清干预Mφ的TLR-1、各剂量给药组含药血清干预Mφ的TLR-2、小剂量给药组含药血清干预Mφ的TLR-3的mRNA表达量明显减弱(P<0.01)。结论 一定浓度大黄牡丹汤含药血清对Mφ吞噬功能和TLRs的表达具有明显调节效应，这可能是该方临床抗炎作用的部分机制。

大黄牡丹汤；巨噬细胞；吞噬功能；Toll样受体

大黄牡丹汤组成为大黄、丹皮、冬瓜仁、桃仁、芒硝等，具有泻热破瘀、散结消肿功效，用于湿热蕴结、气血凝滞所致肠痈等症。该方在临床上广泛用于治疗重症肝炎、胆囊炎、胰腺炎、阑尾炎、结肠炎、盆腔炎等多种炎性疾病〔1〕。长期临床实践中，我院在国家级名老中医符中柱教授的主导下，采用大黄牡丹汤加减治疗肛痈，疗效十分显著〔2〕。活化的巨噬细胞(Mφ)在炎症的启动、发展及恢复阶段均发挥至关重要的调控作用，吞噬功能增强是Mφ活化的重要体现。Toll样受体(TLRs)是Mφ表面的一类重要的模式识别受体，与Mφ活化、吞噬、分泌细胞因子和炎症调控等功能密切相关。为研究大黄牡丹汤临床治疗炎性疾病的部分机制，本文观察其含药血清对Mφ吞噬功能和TLRs表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验药物 大黄牡丹汤组方药材购自北京同仁堂(贵阳店)，按《金匮要略》原方比例(大黄12 g、丹皮3 g、桃仁9 g、冬瓜仁30 g、芒硝9 g)配制，常规制备水煎剂，调整储存浓度为相当于生药3 g/ml，置4℃冰箱在1 w内使用。

1.2 实验动物 制备含药血清选用清洁级SD大鼠，雄性，体重(220±20)g；制备单核/巨噬细胞选用清洁级C57BL/6小鼠，雄性，体重(20±2)g。实验动物均购自重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司，动物合格证 SCXK(军)2012-0011。

1.3 主要试剂 DMEM培养基(美国，Gibco)；Trizol试剂(美国，Invitrogen)；逆转录试剂盒、Taq酶(大连，宝生物)；PCR引物(北京鼎国生物科技有限公司合成)；中性红(上海试剂三厂)；CD11b、F4/80流式细胞仪检测试剂(美国，eBioscience)；M-CSF(美国，PeproTech)；胎牛血清(美国，Gibco)。

1.4 主要仪器 VX-55高压灭菌锅(德国，Systec)；NU-440-400E生物安全柜(美国，Nuair)；DMI3000B显微镜(德国，Leica)；MK3酶标仪、CO2培养箱(美国，Thermo)；3-18K低温离心机(德国，Sigma)；Biometra TProfessional Thermocycler PCR仪(德国，Biometra)；Biorad GelDoc 2000凝胶成像系统(美国，Bio-Rad)；BD FACSAria型流式细胞仪(美国BD)。

1.5 大黄牡丹汤含药血清的制备 参照文献方法并略加调整〔3〕。实验大鼠随机分为正常对照组、大、中、小剂量给药组，每组10只。大黄牡丹汤水煎剂以成人(体重按60 kg计算)用药剂量的等效剂量为小剂量灌胃，大、中、小剂量分别为30、15、7.5 g/kg，灌胃体积为1 ml/100 g；正常对照组代以生理盐水，1次/d，连续3 d。第3天给药结束前12～16 h内禁食不禁水，末次给药后1～2 h股静脉采血，同组血液混合，常规收集血清，在56℃水浴锅中经30 min灭活血清补体，0.22 μm滤膜除菌，置-80℃备用。根据前期结果，大黄牡丹汤含药血清终浓度在20%以内对Mφ无明显毒性〔4〕。故本实验中使用含药血清终浓度为15%。

1.6 小鼠骨髓源Mφ的诱导培养 无菌操作下颈椎脱臼处死小鼠，小心剥离双侧胫骨和股骨，去除肌肉和关节。以1～2 ml 4℃磷酸盐缓冲液(PBS)用1 ml注射器灌洗骨髓，灌洗液收集至无菌离心管中，1 200 r/min离心5 min，弃上清。用与灌洗液等量的DMEM培养基重悬骨髓细胞，5 ml/瓶分装，37℃ 5%CO2培养。3 d后换液1次并继续培养，7 d时光镜下观察细胞形态，消化收集合适细胞并分装为5×105个/管，采用APC标记的F4/80小鼠抗体(1∶100)、FITC标记的CD11b小鼠抗体(1∶100)在4℃下避光孵育20 min后，流式细胞仪检测Mφ比例，纯度超过85%可用于检测后续指标。

1.7 中性红法检测含药血清对Mφ吞噬功能的影响 在96孔板中，加入浓度为5×106个/ml的细胞悬液100 μl，37℃、5% CO2温育贴壁2 h，PBS洗3次，弃上清后每孔加入终浓度为15%的含药血清200 μl，正常对照组加入同浓度正常血清，所有加样设8个复孔。置37℃、5%CO2培养24 h。取出弃培养液，每孔加入用DMEM培养液配置的终浓度为0.002 g/ml的中性红溶液，继续孵育3 h，弃中性红溶液，PBS洗3次，每孔加入细胞溶解液(等体积乙酸和无水乙醇混合液)200 μl，室温下放置24 h裂解细胞，492 nm下测定吸光度。

1.8 RT-PCR法检测含药血清对Mφ的TLR-1～5 mRNA表达的影响 参考文献方法〔3〕。在6孔板中，分别将浓度为1×107个/ml的骨髓源Mφ 1 ml与各组终浓度为15%的实验血清共同孵育24 h后，常规Trizol法提取总RNA，以Oligo-dT为引物逆转录合成第一链cDNA。TLRs引物序列见表1。PCR反应条件：94℃、45 s，53℃、45 s，72℃、1 min，35个循环；反应体系：ddH2O 17.5 μl，10×PCR缓冲液2.5 μl，10×dNTP Mix 2.5 μl，引物10.5 μl，引物20.5 μl，Taq plusDNA 0.5 μl，cDNA 1 μl。结果用Quantity One软件分析，灰度值检测重复8次。

表1 TLRs引物序列

1.9 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1 M-CSF诱导培养小鼠骨髓源Mφ纯度 采用流式细胞仪鉴定Mφ表面CD11b、F4/80分子标记。结果显示，M-CSF诱导培养小鼠骨髓源Mφ纯度达到94.7%。见图1。

2.2 大黄牡丹汤含药血清对Mφ吞噬功能的影响 与正常对照组比较〔(3.961±0.113)〕，大黄牡丹汤大、中、小剂量〔(4.168±0.105)、(4.507±0.15)、(4.226±0.110〕、给药组含药血清干预的Mφ吞噬功能均有明显增强(P<0.05或P<0.01)。

a：对照；b：诱导培养7 d后流式细胞仪检测结果图1 M-CSF诱导培养小鼠骨髓源Mφ纯度

2.3 大黄牡丹汤含药血清对小鼠骨髓源Mφ的TLR-1～5 mRNA表达的影响 核酸电泳分析并检测灰度值见图2、表2。与正常对照组比较，大剂量给药组含药血清干预的TLR-3、各剂量给药组含药血清干预的Mφ的TLR-4和TLR-5的mRNA表达量明显增强(P<0.05或P<0.01)，大、小剂量给药组含药血清干预的Mφ的TLR-1、各剂量给药组含药血清干预的Mφ的TLR-2、小剂量给药组含药血清干预的Mφ的TLR-3的mRNA表达量明显减弱(P<0.01)。

1～4：正常对照组、大剂量给药组、中剂量给药组、小剂量给药组图2 大黄牡丹汤含药血清对小鼠骨髓源Mφ的 TLR-1～5 mRNA表达的影响表2 Mφ的TLRs mRNA表达量的灰度值分析

组别TLR-1TLR-2TLR-3TLR-4TLR-5正常对照组16.74±1.6014.33±1.497.21±1.1211.29±1.333.79±0.91大剂量给药组8.92±1.162)1.88±0.702)9.17±1.011)14.84±1.112)12.60±1.342)中剂量给药组17.13±1.621.60±0.182)7.41±1.6514.90±1.042)14.13±2.012)小剂量给药组12.02±1.162)5.69±1.172)3.27±0.662)13.44±1.091)13.75±1.852)

与正常对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

3 讨 论

血清药理学方法是田代真一〔5〕在二十世纪八十年代末提出的一种药理研究技术。因其具有“半体内”的特点，所以能更贴近真实地反应中药在体内的作用及机制，受到中药尤其是中药复方研究者的关注。Mφ是机体免疫系统的一种重要的细胞成员，具有识别、吞噬、抗原提呈、炎症调控等重要作用。Mφ经各种因素刺激活化而发挥功能，吞噬功能的增强是其活化的重要表现之一〔6〕。TLRs是近年来在Mφ表面发现的一类重要的模式识别受体，其中TLR1-5对Mφ识别、活化和发挥炎症调控效应至关重要〔7〕。金匮大黄牡丹汤是临床上治疗炎症性疾病的重要方剂，在我院治疗肛痈的实践中也表明其疗效十分显著〔2〕。在本实验中，为了尽可能接近Mφ在体内的真实情况，我们采用小鼠骨髓源Mφ作为实验材料，并用血清药理学技术作为实验方法。实验结果显示：M-CSF诱导的小鼠骨髓源Mφ纯度可达到90%以上，能够满足实验要求；在一定浓度的大黄牡丹汤含药血清干预下，小鼠骨髓源Mφ的吞噬功能明显增强，提示该方具有调节Mφ活性的作用；一定浓度的大黄牡丹汤含药血清对Mφ表面TLRs中的TLR-1～5 mRNA的表达具有促进或抑制作用，这可能与该方临床炎症调控效应的作用机制有关，其具体调控途径有待进一步研究。

1 张保国，刘庆芳.大黄牡丹汤现代药效学研究与临床应用〔J〕.中国药学杂志，2009；44(21)：1601-4.

2 李 可.符中柱教授运用《金匮要略》理论治疗肛痈的临床体会〔J〕.中医临床研究，2011；3(7)：68.

3 张智伟，蔡 琨，吴玛莉，等.紫花地丁含药血清对巨噬细胞吞噬功能及TOLL样受体表达的影响〔J〕.中国免疫学杂志，2014；30(6)：759-62.

4 苗大兴，肖天保，梁宛伶.大黄牡丹汤含药血清对巨噬细胞释放炎症因子的影响〔J〕.时珍国医国药，2014；25(4)：843-5.

5 田代真一.和汉药の实验的研究におる诸问题-invitro实验の问题〔J〕.和汉医药学会杂志，1991；(3)：218-21.

6 Fujiwara N，Kobayashi K.Macrophages in inflammation〔J〕.Curr Drug Targets Inflamm Allerg，2005；4(3)：281-6.

7 Akira S，Takeda K，Kaisho T.Toll-like receptors：critical proteins linking innate and acquired immunity〔J〕.Nat Immunol，2001；2(8)：675-80.

〔2015-12-05修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

贵州省科技厅联合基金项目(黔科合中药字〔2012〕LkZ7047)

苗大兴(1970-)，男，硕士，副主任医师，硕士生导师，主要从事肛肠病中西医结合治疗的临床与基础研究。

R285

A

1005-9202(2017)08-1891-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.029