槲皮素对人成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

詹雪芬 司鹤南 姚海舟 田亚萍

(温州医科大学附属第二医院育英儿童医院，浙江 温州 325000)

槲皮素对人成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

詹雪芬 司鹤南1姚海舟2田亚萍1

(温州医科大学附属第二医院育英儿童医院，浙江 温州 325000)

目的 探讨槲皮素对人成纤维细胞(HSF)生长及胶原分泌能力的影响。方法 原代培养HSF，并以不同浓度的槲皮素干预24 h，以MTT法检测细胞增殖能力，以流式细胞术测定其细胞周期，对培养上清用碱水解法测定其中羟脯氨酸(Hyp)含量，酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)及透明质酸(HA)含量。结果 槲皮素作用HSF 24 h后，与对照组比较，槲皮素各剂量组细胞处于增殖期的细胞数目、增殖能力逐渐增加(P<0.05)，并呈现一定的剂量效应关系；不同浓度槲皮素作用于HSF 24 h后，培养上清中Hyp、Col Ⅰ及HA含量均明显高于对照组(P<0.05)，并具有剂量-效应关系。结论 槲皮素可促进HSF增殖、刺激其分泌胶原及HA，对维持皮肤弹性、减少皮肤皱纹形成、延缓衰老有重要意义。

槲皮素；人成纤维细胞

人皮肤真皮层主要由人皮肤成纤维细胞(HSF)及其分泌的基质构成，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用。真皮中HSF的老化及其调控代谢的基质退行性变化，是造成皮肤出现皱纹、松弛、僵硬等老化现象的最直接原因〔1〕。真皮中的基质主要由胶原纤维(胶原)构成，其主要生化成分是Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)和透明质酸(HA)，是评价皮肤老化机制的重要指标。槲皮素是一种多羟基黄酮类化合物，化学名为3，3′，4′，5，7-五羟基黄酮，具有抗氧化及清除自由基的作用，近年来其抗衰老价值逐渐引起学者的重视〔2〕。本研究旨在探讨槲皮素对HSF生长及胶原分泌能力的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 槲皮素(Q4951)、MTT、碘化丙啶(PI，sigma公司)；羟脯氨酸(Hyp)测定试剂盒(A030-1，南京建成生物工程研究所)；人 Col I试剂盒(E-EL-H0130)、人HA试剂盒(E-EL-H0130)；HA(E-EL-0036，Elabscience 公司)；RPMI-1640、血清(Invitrogen公司)。其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 人皮肤原代成纤维细胞(HSF)的培养、传代及鉴定〔2〕健康男子包皮环切术切除的包皮，经无菌pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)反复漂洗、去除多余结缔组织后，置0.25%胰蛋白酶溶液中4℃孵育过夜。次日取出皮肤后，刮去表皮和皮下肌肉及脂肪组织，将保留的真皮组织剪碎，置0.25%胶原酶Ⅳ中37℃孵育4 h。消化液经200目筛网过滤，1 000 r/min离心15 min，弃上清，用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液轻轻吹打沉淀，制成细胞悬液，计数并接种至培养皿，于37℃、5%CO2静止培养3 d后，若细胞贴壁良好，则以后隔日换液，至细胞生长汇合率达90%以上时，按1∶3传代培养，待细胞传代至第3代时进行鉴定。

1.2.2 细胞增殖能力的测定 以MTT法检测细胞增殖能力：将处于对数生长期的HSF以 1×102/L细胞密度接种至96孔细胞培养板，待细胞完全贴壁后，换用含不同浓度槲皮素(12.5、25、50 μmol/L)的无血清RPMI-1640培养液继续培养24 h。以正常无血清RPMI-1640培养液作为对照组，每组设6个复孔。每孔加入20 μl、5 mg/ml MTT溶液继续孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μl二甲亚砜(DMSO)以充分溶解沉淀，于490 nm下测定吸光度值(A)。

1.2.3 Hyp含量影响的测定 将处于对数生长期的HSF以5×107/L细胞密度接种至6孔细胞培养板，待细胞完全贴壁后，换无血清RPMI-1640培养液继续培养12 h以同步化细胞生长，然后换用含不同浓度槲皮素的无血清RPMI-1640培养液继续培养24 h。以正常无血清RPMI-1640培养液作为对照组，每组设6个复孔。收集培养上清液按Hyp测定试剂盒说明书进行测定。

1.2.4 HSF周期检测 将1.2.3收集上清液后的培养细胞经0.25%胰酶消化，70%冷乙醇固定、PI染色后用流式细胞仪检测细胞周期。计算增殖指数(PI)，即处于增殖期(包括S期及G2期)的细胞所占总细胞的百分数。

Hyp含量(μg/ml)=(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(5 μg/ml)×样本测试前稀释倍数。

1.2.5 Col I及HA含量测定 取1.2.3中收集的细胞培养上清液按酶联免疫吸附试验(ELISA)测定Col Ⅰ及HA含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 槲皮素对HSF增殖能力的影响 槲皮素作用HSF 24 h，附着槲皮素剂量的增加，其刺激HSF增殖作用逐渐增加，与对照组(0.522±0.026)比较，槲皮素低、中、高剂量细胞A值(0.624±0.051，0.944±0.054，1.074±0.082)均明显增加(P<0.05)；槲皮素各剂量组间比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。

2.2 槲皮素对HSF细胞周期的影响 随着槲皮素作用浓度的增加，处于增殖期的细胞数目逐渐增加，不同浓度槲皮素组PI均明显高于对照组(P<0.05)，与槲皮素低剂量组比较，槲皮素高剂量组HSF PI明显增加(P<0.05)。见表1。

表1 槲皮素对HSF细胞周期的影响

与对照组比较：1)P<0.05；与槲皮素低剂量组比较：2)P<0.05

2.3 槲皮素对HSF培养上清Hyp、ColⅠ、HA含量影响 不同浓度槲皮素作用于HSF 24 h后，培养上清中Hyp、ColⅠ、HA含量均明显高于对照组(P<0.05)，槲皮素各处理组之间两两比较发现，各浓度槲皮素组Hyp、ColⅠ、HA含量差异均有统计学意义(P<0.05)，呈现出了明显的剂量-效应关系，见表2。

表2 槲皮素对HSF培养上清Hyp、ColⅠ、 HA含量的影响

与对照组比较:1)P<0.05；与槲皮素低剂量组比较:2)P<0.05；与槲皮素中剂量组比较:3)P<0.05

3 讨 论

皮肤真皮层主要细胞是成纤维细胞，皮肤老化主要表现为HSF增殖能力下降，数量减少，抗酶破坏力降低，合成和分泌胶原纤维的数量和质量也逐渐减少，导致真皮厚度变薄，弹性变差，以致出现皮肤出现松弛与褶皱〔3〕。本研究结果表明槲皮素可刺激HSF增生，从而起到延缓衰老作用。

HSF主要功能之一是合成和分泌ColⅠ和ColⅢ，后者是皮肤光滑、柔嫩、弹性程度的主要决定因素〔4〕。Hyp是胶原纤维与胶原蛋白中的一种主要而又相对恒定的氨基酸，常用来评价组织中总胶原含量。研究发现，老年人的Hyp比年轻人要少〔5〕。本研究结果发现槲皮素可刺激HSF分泌Col Ⅰ，表明槲皮素可能对维持皮肤弹性、减少皮肤皱纹有一定作用。

HA是一种酸性黏多糖，参与润滑关节、调节血管壁的通透性、调节蛋白质、促进创伤愈合等。对于皮肤，HA由HSF产生，是一种多功能基质，具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子(NMF)。同时HA还可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂。正常情况下，皮肤组织中含有大量的HA，随着年龄不断增长，HA的含量不断减少，活性也随之降低。本研究表明槲皮素可能对维持机体HA的正常水平、延缓衰老有重要意义。

1 Chung JH，Seo JY，Choi HR，etal.Modulation of skin collagen metabolism in aged and photoaged human skin in vivo〔J〕.J Invest Dermatol，2001；117(5)：1218-24.

2 赵 娟，石 艳，孙 波，等.人皮肤成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定〔J〕.吉林大学学报(医学版)，2008；34(5)：899-902.

3 Rohrer TE.Soft tissue filler substances〔J〕.Curr Prob Dermatol，2001；13(4)：7-10.

4 李晓格，李世荣，曹 川.强脉冲光对皮肤成纤维细胞胶原合成的影响及其机制探讨〔J〕.中国美容医学杂志，2010；19(11)：1643-5.

5 芦 源，张 鸥.皮肤老化及其防治研究进展〔J〕.中国中医基础医学杂志，2001；7(8)：69-71.

〔2016-12-20修回〕

(编辑 滕欣航)

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目资助(2015-515)

田亚萍(1973-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事皮肤衰老研究。

詹雪芬(1968-)，女，主管护师，主要从事衰老机制研究。

R28

A

1005-9202(2017)08-1845-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.010

1 吉林大学第一医院皮肤性病科

2 吉林大学基础医学院分子生物学系