血清miR-21和miR-34a与晚期胃癌患者Folfox化疗方案化疗疗效的关系研究

董 峰 马君俊 蔡正昊 赵 轩 郑民华

血清miR-21和miR-34a与晚期胃癌患者Folfox化疗方案化疗疗效的关系研究

董 峰 马君俊 蔡正昊 赵 轩 郑民华

目的 探讨晚期胃癌患者Folfox方案化疗前后血清miR-21和miR-34a水平变化及其与化疗疗效的关系。方法 以在我院接受Folfox方案化疗的45例晚期胃癌患者为研究对象。采用Real-time PCR检测化疗前后miR-21和miR-34a水平，分析miR-21和miR-34a水平与化疗疗效和患者预后的关系，采用受试者工作曲线(ROC)评估miR-21和miR-34a对化疗疗效的评估。结果 化疗后，部分缓解6例(13.33%)、疾病稳定10例(22.22%)、疾病进展29例(64.44%)，客观缓解率为13.33%，疾病控制率为35.56%，中位生存期为8.1个月。化疗后miR-21水平下调，而miR-34a水平上调，差异有统计学意义(P<0.05)。化疗有效组miR-21水平低于无效组，而miR-34a水平高于无效组，差异有统计学意义(P<0.05)。miR-21与化疗疗效呈负相关，miR-34a与之呈正相关(rs=-0.431，0.504，P<0.05)。miR-21低水平患者中位生存期7.6个月，而高水平患者为6.0个月；miR-34a低水平患者中位生存期5.5个月，而高水平患者为8.3个月，Log-Rank检验显示，miR-21低水平患者中位生存期大于高水平患者(P<0.05)，miR-34a高水平患者中位生存期大于低水平患者(P<0.05)。miR-21和miR-34a联合评估化疗疗效的曲线下面积为0.865、灵敏度为80.9%、特异度为89.8%。结论 血清miR-21和miR-34a与晚期胃癌化疗疗效和患者中位生存期相关。

微小RNA；晚期胃癌；化疗疗效；中位生存期

胃癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，我国每年胃癌新发人数约占全球胃癌新发人数的40%以上[1-2]。早期胃癌通常行外科手术根治切除，术后5年生存率在90%以上；然而早期胃癌并无明显临床症状，直至发现时，大约1/3的患者已处于晚期阶段[3-4]。晚期胃癌主要采用Folfox方案化疗治疗[5]。miRNA是近几年来被大量研究的一类非编码单链小分子RNA，有研究报道miRNA异常表达与肿瘤药物化疗敏感性有关，在化疗疗效评价和预后判断等方面发挥重要作用[6-7]。本研究通过检测化疗前后患者血清miR-21和miR-34a水平变化，分析其与化疗疗效和患者预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年5月—2015年10月，在我院接受Folfox方案化疗的45例晚期胃癌患者为研究对象。其中男性31例，女性14例；年龄35～77岁，平均年龄(59.7±8.6)岁；低分化27例，中高分化18例；TNM分期，Ⅲ期20例，Ⅳ期25例；美国东部肿瘤协作组(ECOG)评分，0～1分的18例，2分的27例。纳入标准：经组织病理学检查确诊为晚期胃癌；均为首次治疗，既往无放化疗史；ECOG评分≤2分；无严重肝肾肺等器官功能障碍者。排除标准：合并糖尿病、高血压等其它慢性疾病者；合并其它恶性肿瘤者；存在精神障碍无法配合者。所有患者均签署知情同意书，并经本院医学伦理委员会批准。

1.2 化疗方法

所有患者均采用Folfox化疗方案：第1 d，奥沙利铂，130 mg/m2，持续静脉滴注2 h；第1 d，亚叶酸钙，400 mg/m2，持续静脉滴注2 h；氟尿嘧啶，2 400 mg/m2，持续静脉滴注46 h。一个化疗周期为21 d，一共进行2个周期的化疗。

1.3 疗效判定

疗效判定参考(WHO)制定的实体瘤疗效评价标准(RECIST 1.1版)：完全缓解(CR)：所有靶病灶全部消失；部分缓解(PR)：所有靶病灶的最大长径总和减少30%或以上；疾病稳定(SD)：所有靶病灶的最大长径总和减少小于30%或增大20%以下；疾病进展(PD)：所有靶病灶的最大长径总和增大20%或以上。客观缓解率(ORR)=(CR+PR)/总例数，疾病控制率(DCR)=(CR+PR+SD)/总例数。

1.4 Real-time PCR检测miR-21和miR-34a水平

(1)采集对象空腹肘静脉血，离心取上层血清，按miRNeasy Serum/Plasma Kit提取试剂盒操作提取血清miRNA，采用Nano Drop 2 000 c评估样品质量；(2)按反转录试剂盒操作逆转录合成cDNA。体系：5×miScript HiSpec Buffer 2 μL，10×miScript Nucleics Mix 1 μL，miScript Reverse Transcriptase 1 μL，RNase-free Water 3 μL，模板miRNA 3 μL。条件：16℃/30 min，42℃/30 min，85℃/5 min；(3)以cDNA为模板，进行Real-time PCR扩增。体系：2×SYBR Green PCR Mix 5 μL，10×miScript Universal Primer(通用下游引物)1 μL，特异性上游引物1 μL，RNase-free Water 2 μL，模板cDNA 1 μL，共计10 μL。条件：95℃/15 min，94℃/15 s、55℃/30 s、70℃/30 s，共40个循环。所需引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成(表1)。目的基因相对表达水平ΔCt=目的基因Ct值-内参Ct值，ΔCt化疗前=Ct化疗前-U6，ΔCt化疗后=Ct化疗后-U6。ΔCt值越大，目的基因相对表达水平越低，ΔCt值越小，目的基因相对表达水平越高。

表1 miRNAs特异性引物

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 化疗前后血清miR-21和miR-34a水平比较

与化疗前比较，化疗后患者血清miR-21相对表达水平显著降低[(2.015±1.054)vs.(2.809±2.321)]；而血清miR-34a相对表达水平显著升高[(2.419±1.215)vs.(1.323±0.071)]，差异均有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 晚期胃癌患者化疗前后血清miR-21和miR-34a水平比较

2.2 miR-21和miR-34a水平与化疗疗效的关系

45例患者经化疗后，CR 0例，PR 6例(13.33%)，SD 10例(22.22%)，PD 29例(64.44%)，ORR 6例(13.33%)，DCR 16例(35.56%)。根据化疗疗效将患者分为有效组(CR+PR+SD，n=16)和无效组(PD，n=29)。化疗有效组患者化疗后miR-21水平明显低于无效组(3.532±2.383vs. 2.064±1.055)，化疗有效组患者化疗后miR-34a水平明显高于无效组(1.006±0.051vs. 2.531±1.258)，差异均有统计学意义(P<0.05)(表3)。Spearman秩相关分析，miR-21与化疗疗效呈负相关(rs=-0.431，P<0.05)，miR-34a与化疗疗效呈正相关(rs=0.504，P<0.05)。

2.3 miR-21和miR-34a水平与预后的关系

化疗后，45例患者miR-21和miR-34a平均值为(2.809±2.321)和(1.323±0.071)，高于均值的定义为高水平，低于均值的定义为低水平。miR-21低水平患者21例，中位生存期7.6个月；高水平患者24例，中位生存期6.0个月。Log-Rank检验显示，miR-21低水平患者中位生存期显著大于高水平患者(P<0.05)。miR-34a低水平患者27例，中位生存期5.5个月；高水平患者18例，中位生存期8.3个月。Log-Rank检验显示，miR-34a高水平患者中位生存期显著大于低水平患者(P<0.05)。(图1)。

表3 化疗有效组和无效组miR-21和miR-34a水平比较

图1 不同水平miR-21和miR-34a患者的生存曲线Figure 1 Survival curves of patients with different levels of miR-21 and miR-34aNote：Left：Survival curves of patients with different levels of miR-21；Right：Survival curves of patients with different levels of miR-34a.

2.4 miR-21和miR-34a对化疗疗效的评估

miR-21和miR-34a 联合评估化疗疗效的曲线下面积(Area under curve，AUC)为0.865、灵敏度为80.9%、特异度为89.8%(表4)。

表4 miR-21和miR-34a对化疗疗效的评估

3 讨论

目前，针对晚期胃癌患者临床上主要采用以铂类化合物为基础的化疗方法，然而由于肿瘤细胞对铂类化合物存在耐药，多数患者经一线化疗后临床效果并不令人满意，必须进行二线甚至三线化疗[8]。目前国内外大都采用RECIST实体瘤疗效评价法对化疗疗效进行评价，然而该方法存在周期长、费用高昂等不足之处[9]。因此，寻找预测铂类化合物化疗疗效的敏感标志物具有重大的临床应用价值，以便对化疗疗效进行及时有效的评估，及时区分对化疗不敏感的患者，并及时调整化疗方案。

miRNA参与了各种类型肿瘤的发生、发展[10]，其作为新的血液肿瘤标志物，在肿瘤化疗疗效评价以及预后判断方面的研究应用已成为近几年来的热点话题。Wei等[11]研究发现，与进展期肺癌患者相比，化疗后缓解患者的血清miR-21显著下降，提示miR-21可作为肺癌对铂类化疗药物敏感性的评价指标。Wang等[12]研究发现，血清miR-21低表达肺癌患者，其3年存活率明显大于高表达患者，提示血清miR-21是判断肺癌患者存活期的独立预测因素。Yang等[13]研究显示，对顺铂耐药的胃癌SGC7901/DPP细胞株中miR-21的表达明显上调，而下调该细胞株中miR-21的表达可显著增加其对顺铂的敏感性。刘明明等[14]研究显示，过表达肺癌A549/DDP细胞株中miR-34a可明显增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性，其机制可能与降低耐药基因表达有关。Cao等[15]研究证实，胃癌SGC-7901/DDP细胞株中miR-34a的表达显著上调，而过表达该细胞株中miR-34a的表达可明显增加其对顺铂的敏感性。基于以上研究，我们认为miR-21和miR-34a与包括胃癌在内的多种恶性肿瘤的化疗疗效有关。因此，通过检测化疗前后miR-21和miR-34a水平的变化能够预测化疗疗效和预后。血清中miRNA可以抵抗内源性RNase酶的降解作用，非常稳定，然而成熟的miRNA片段非常短，且其在血清中的含量非常少，因此对于检测技术的要求非常高，目前通常采用实时荧光定量PCR技术检测其表达情况。

本研究采用Real-time PCR检测化疗前后miR-21和miR-34a水平，结果显示，化疗后患者血清miR-21表达水平明显下调而miR-34a表达水平明显上调，提示miR-21和miR-34a可能参与了胃癌的发生、发展。为进一步探讨miR-21和miR-34a在晚期胃癌Folfox方案化疗疗效预测中的作用，本研究比较了化疗有效组和无效组患者血清miR-21和miR-34a中的水平，结果显示，化疗后，有效组患者miR-21水平低于无效组而miR-34a水平高于无效组。相关性分析显示miR-21与化疗疗效呈负相关，而miR-34a与之呈正相关。与此同时，本研究进一步分析了miR-21和miR-34a与患者生存期的关系，结果显示，miR-21低水平患者中位生存期大于高水患者，而miR-34a低水平患者中位生存期低于高水平患者。相关性分析显示miR-21与中位生存期呈负相关，而miR-34a与之呈正相关。以上结果提示miR-21和miR-34a与化疗疗效和患者预后密切相关。ROC曲线评估结果显示，miR-21联合miR-34a预测化疗疗效的曲线下面积(AUC)为0.865、灵敏度为80.9%、特异度为89.8%。

综上所述，血清miR-21和miR-34a与晚期胃癌化疗疗效和患者中位生存期相关。本研究尚存在以下不足：样本量较少且来源单一，缺少大样本多中心的临床研究；随访时间较短，缺少远期生存分析。欲深入探讨miR-21和miR-34a与晚期胃癌患者化疗疗效间的关系，尚需更多、更全面的研究，这也是本研究下一步研究的方向。

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13 Yang SM，Huang C，Li XF.miR-21 confers cisplatin resistance in gastric cancer cells by regulating PTEN[J].Toxicology，2013，306(2)：162-168.

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(收稿：2016-10-25)

The correlation between serum miR-21 and miR-34a expression and the efficacy of Flofox chemotherapy regimen in patients with advanced gastric carcinoma

DONGFeng，MAJunjun，CAIZhenghao，ZHAOXuan，ZHENGMinhua

Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai Minimal Invasive Surgery Center，Shanghai 200025，China

Objective The objective of this study was to investigate the levels of serum miR-21 and miR-34a in patients with advanced gastric cancer before and after Folfox chemotherapy and its relationship with chemotherapy efficacy.Methods Forty-five patients with advanced gastric cancer who underwent Folfox chemotherapy were enrolled from May 2015 to October 2015.The levels of miR-21 and miR-34a were analyzed by Real-time PCR before and after chemotherapy.The relationship between miR-21 and miR-34a levels and chemotherapy efficacy was analyzed.The predictive values of miR-21 and miR-34a on the efficacy of chemotherapy were evaluated by the receiver operating curve(ROC).Results After chemotherapy，6 cases(13.33%)were relieved，10 cases(22.22%)were stable disease(SD)，29 cases(64.44%)were disease progress(PD)，the objective response rate(ORR)was 13.33%，the disease control rate(DCR)was 35.56%，the median survival time was 8.1 months.The level of miR-21 was down-regulated and up-regulation for miR-34a after chemotherapy.They were statistically significant(P<0.05).The level of miR-21 in the chemotherapy group was lower than that in the ineffective group，and the level of miR-34a was higher than that of the ineffective group(P<0.05).MiR-21 was negatively correlated with the efficacy of chemotherapy(rs=-0.431，P<0.05)，while miR-34a was positively correlated with it(rs=0.504，P<0.05).The median survival time was 7.6 months for low-level patients with miR-21 and 6.0 months for high-level patients.The median survival time of miR-34a patients was 5.5 months，compared with 8.3 months for high-level patients，with a statistically significant difference(P<0.05).The Log-Rank test showed that the median survival of patients with low miR-21 was higher than that of patients with high miR-21(P<0.05).The median survival of patients with high miR-34a was higher than that of patients with low miR-34a(P<0.05).The miR-21 combined with miR-34a in predicting chemotherapy efficacy under the curve(AUC)was 0.865，the sensitivity was 80.9% and the specificity was 89.8%.Conclusion miR-21 and miR-34a are correlated with chemotherapy efficacy median survival time of patients with advanced gastric cancer.

miRNA；Advanced gastric cancer；Chemotherapy efficacy；Median survival time

上海交通大学医学院附属瑞金医院；上海市微创外科临床医学中心(上海 200025)

董峰，男，(1971-)，硕士，副主任医师，从事胃肠道肿瘤的微创手术及分子靶向综合治疗的研究。

董峰，E-mail：kong6907@126.com

R453.9

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.02.010