miR-345在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

胡海峰 冯谢敏 乔 健 段 伟 刘宁宁 孙晓东

miR-345在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

胡海峰 冯谢敏 乔 健 段 伟 刘宁宁 孙晓东

目的 探讨microRNA-345(miR-345)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达情况，并进一步分析其与肿瘤的临床病理特征和预后关系。方法 利用Real-time PCR检测98例NSCLC患者组织及三种细胞系中miR-345的表达，分析miR-345的表达与临床预后的关系。结果 和对照组相比，miR-345的表达在NSCLC组织及细胞系中显著下调(P<0.05)；组织中miR-345的表达水平和临床病理指标包括淋巴结转移(P<0.001)、远端转移(P=0.028)、TNM分级(P=0.004)以及病理分期(P=0.011)有关；低表达miR-345的NSCLC患者组和高表达miR-345的患者组相比，其总生存率较低(P=0.021)。多因素分析表明miR-345的表达是NSCLC预后的独立危险因素(HR=3.897，95%CI：2.263～10.440；P=0.012)。结论 miR-345在NSCLC组织及细胞系中的表达降低，低表达的miR-345和NSCLC的进展及预后有关，表明miR-345可能作为NSCLC的一个潜在临床诊断标记。

生物标记；miR-345；非小细胞肺癌；预后

肺癌是全球范围内癌症死亡的主要原因之一，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占其中的大约80%[1]。近年来，尽管手术、化疗以及靶向治疗等对肺癌患者的治疗取得了很大的进步，但是NSCLC患者的5年生存率依然较低[2]。因此，寻找一些高特异性和敏感性的生物标记对NSCLC的早期诊断和恶性疾病的预后具有重要的临床意义。

微小RNA(miRNAs)是一类小的非编码RNA，对基因表达的调控起着重要的作用[3]。miRNAs的表达改变对许多疾病的发生和发展起着关键作用，包括癌症。一些miRNA在肺癌的探测、诊断和治疗中具有很好的前景[4-5]。Nadal等[6]通过基因表达谱分析NSCLC和健康受试者血清miRNAs的表达，发现很多差异表达的血清miRNAs，联合四个miRNAs(miR-193b，miRNA-301，miR-141和miR-200b)可以从健康对照人群中准确鉴别NSCLC患者。最近Mavridiset等[7]报道，miR-197在NSCLC组织中表达上调且与肿瘤的大小及分型密切相关。除此之外，miR-197的过表达是NSCLC恶性预后的独立预警分子，表明miR-197可能作为NSCLC的潜在癌基因。

miR-345的表达失调是多种类型癌症的普遍特征，包括前列腺癌、结肠癌以及急性淋巴细胞白血病[8-10]。然而，其在NSCLC患者组织中的表达尚不清楚，本研究对miR-345在NSCLC中的表达情况以及其潜在的临床意义进行探讨。

1 材料与方法

1.1 研究对象及临床样本

收集2011年6月—2013年1月在我院手术切除的NSCLC组织标本及正常肺组织标本(距肺癌>5 cm)共98例。所有患者均经病理确诊为NSCLC，且所有患者均签署患者知情同意书。所有患者术前均未接受过任何放化疗、生物治疗或靶向治疗，手术切除的标本迅速放入液氮中保存，后转到-80℃冰箱中保存，且整个收集及保存过程均按照无酶原则操作。NSCLC根据美国癌症联合委员会第四版关于肺癌TNM分级系统进行分级。总体生存时间为在我院确诊为NSCLC到死亡的时间间隔。NSCLC病人的临床数据见表1。

1.2 主要试剂

RNA反转录试剂盒、TaqMan Universal PCR Master Mix试剂盒、microRNA荧光实时定量PCR试剂盒、miR-345引物、U6B均购于大连Takara公司；miRVana RNA提取试剂盒及Trizol购于美国Invitrogen公司。

1.3 细胞培养

选取腺癌细胞A549、鳞癌细胞H157和大细胞癌细胞H460三种NSCLC细胞株，和一株正常的人成纤维细胞株(MRC-9)均购自于美国ATCC公司。NSCLC细胞株培养基为含10%的胎牛血清、链霉素100 mg/mL、青霉素100 U/mL的RPMI 1640培养基，正常细胞株于α-MEM培养基，细胞培养在37℃、5% CO2相对湿度90%的培养箱中，间隔2～3天更换培养基。

1.4 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

根据用户说明书用Trizol从NSCLC、正常组织及细胞系中提取总RNA。20 μL RNA根据RNA逆转录试剂盒说明书反转录成cDNA。取反转录产物，按照TaqMan Universal PCR Master Mix试剂盒说明书在Real-time PCR仪上进行PCR反应。反应体系：1 μL cDNA(500 ng/20 μL)，0.6 μL primer(10 pmol/L)，10 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，无RNase水8.4 μL。反应条件：95℃ 5 min预热，95℃ 30 s变性，60℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，40个循环。引物序列，miR-345：正向引物5′-GCTGACTCCTAGTCCA-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6B：正向引物5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。反应结束后得到各反应管的循环阈值(Ct)，miR-345的相对表达量采用2-△△Ct法对基因表达量进行相对定量。

1.5 统计学方法

所有的数据均使用SPSS 18.0软件进行分析，使用Mann-Whitney U检验比较NSCLC组织和癌旁组织miR-345的表达水平，方差分析比较不同细胞系中miR-345的表达水平。使用χ2检验分析miR-345的表达水平和临床病理指标的关系。总生存分析采用Log-rank检验，生存曲线使用Kaplan-Meier分析。使用Cox比例风险模型进行单因素和多因素分析探讨NSCLC预后的独立危险因素，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-345在NSCLC组织及细胞系中的表达

荧光实时定量PCR比较miR-345在NSCLC组织和细胞系中的表达，结果显示miR-345的表达在NSCLC组织和正常肺组织相比显著降低(P<0.01)(图1)。同时，和正常人成纤维细胞系相比，三株NSCLC细胞系中miR-345的表达均下调(P<0.05)(图2)。

2.2 组织miR-345与NSCLC临床指标的相关性

实验结果显示miR-345的表达与淋巴结转移(P<0.001)、远端转移(P=0.028)、TNM分级(P=0.004)以及病理分期(P=0.011)相关。而miR-345的表达和年龄(P=0.960)、性别(P=0.649)以及家族史(P=0.215)无关(表1)。

图1 miR-345在NSCLC组织中的表达Figure 1 The expression level of miR-345 in NSCLC tissues

图2 miR-345在NSCLC组织中的表达Figure 2 The expression level of miR-345 in NSCLC cell linesNote：*P<0.05，**P<0.01，compared to MRC-9.

CharacteristicsnmiR-345expressionLow(n=45)High(n=53)PAge(years)0.960≤60462125>60522428Gender0.649Female462026Male522527Lymphaticmetastasis<0.001No422913Yes561640Distantmetastasis0.028No472720Yes511833TNMstage0.004Ⅰ～Ⅱ523121Ⅲ～Ⅳ461432Pathologicalgrade0.011Well/Moderate412516Poor572037Familyhistory0.215No904347Yes826

2.3 总生存分析

以组织miR-345的平均表达水平(0.78)作为标准，将98例NSCLC患者分为高表达miR-345组和低表达组。组织中高表达miR-345的NSCLC患者组中位生存时间为37.5个月(95%CI，30.2～42.4个月)，明显长于组织中低表达miR-345的NSCLC患者组(21.3月，95%CI，18.4～24.6个月)(P=0.021)(图3)。

图3 总生存时间和miR-345表达水平的关系Figure 3 The association between overall survival and miR-345 expression

2.4 NSCLC患者预后的影响因素分析

单因素分析结果显示淋巴结转移(HR=3.623，95%CI：1.193～5.698；P=0.021)、远端转移(HR=3.126，95%CI：1.798～7.614；P=0.004)、TNM分级(HR=4.021，95%CI：2.405-9.997；P=0.009)、组织miR-345的表达水平(HR=3.431，95%CI：1.762-7.309)和总生存时间降低明显相关(表2)。

多因素分析结果显示淋巴结转移(HR=3.019，95%CI：1.621～7.009；P=0.042)、远端转移(HR=3.596，95%CI：2.298～8.908；P=0.009)、TNM分级(HR=4.798，95%CI：2.950-11.991；P=0.007)、组织miR-345表达水平(HR=3.897，95%CI：2.263～10.440；P=0.012)是NSCLC预后的独立危险因素(表2)。

表2 Cox回归模型对总生存时间的单因素和多因素分析

3 讨论

miRNA在癌症的发展过程中起着重要的作用[11-12]。miRNA的突变或者异常表达是肺癌患者表现的普遍特征，因此基于miRNA的治疗对改善恶性疾病的临床预后具有很大的潜力[13-14]。miR-345的表达改变和癌症、系统性红斑狼疮以及癫痫等疾病相关[15-16]。本研究表明miR-345的表达在NSCLC组织及细胞系中下调。同时，组织miR-345的表达和NSCLC的一些临床指标具有相关性，包括淋巴结转移、远端转移、TNM分期及肿瘤临床分级。除此之外，组织中低表达miR-345的NSCLC患者通常总生存期(OS)较低。组织miR-345是NSCLC预后差的独立预警分子。从目前来看，本研究表明miR-345可能在NSCLC的发展过程中扮演着抑制性的角色。由于组织miR-345的表达和NSCLC的临床指标密切相关，因此它有可能作为这类恶性疾病的一个非常有前景的诊断和预后生物标记。同时，与本研究结果相类似，Chen等[17]的研究也表明miR-345的异位表达在体内外都具有抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和浸润的能力。此外，Smad1被鉴定为miR-345的直接下游靶基因，表明miR-345很有可能在前列腺癌中是一个肿瘤抑制基因。Srivastava和他的研究团队的研究结果也发现，miR-345的表达在胰腺癌(PC)患者组织及细胞系中和对照组相比显著降低。在体外上调miR-345的表达可以抑制胰腺癌细胞的增殖，并通过Bcl-2基因诱导细胞凋亡，表明恢复miR-345的表达可能成为治疗胰腺癌的一种有效的手段[18]。同时也有类似研究表明miR-345是一个甲基化敏感的miRNA，它在结肠癌(CRC)组织中表达下调。除此之外，miR-345的表达下调还与淋巴结转移以及组织学分型相关。miR-345的过表达可以通过靶向Bcl-2相关的永生基因3(Athanogene 3)抑制结肠癌细胞系的增殖和侵袭。因此，miR-345可能是结肠癌肿瘤发生的负调控因子[19]。

然而，miR-345还可能在肿瘤发生过程中扮演癌基因的角色。Schou等[20]的研究表明miR-345在全血中的高表达可以作为结肠癌患者整体生存率及预后较差诊断的生物学标记。同时，miR-345的表达上调和西妥昔单抗及伊立替康治疗的耐药性相关。miR-345在结肠癌中可能是癌基因，这和Tang及其研究团队的报道相悖[19]。和正常口腔黏膜相比，miR-345的表达在口腔黏膜白斑病组织中表达升高，且这类组织中核的数目及核/质比增加。这些结果表明miR-345在促进口腔癌前病变进展为口腔鳞状细胞癌扮演着重要角色[21]。Guled等[22]比较了间皮瘤组织和正常对照组织中差异表达的miRNAs，发现miR-345在恶性间皮瘤中的表达显著上调，表明miR-345可能促进这类恶性疾病的进展。为什么在不同类型的肿瘤甚至是同种类型的肿瘤中miR-345扮演着相反的角色？最主要可能有以下两个方面的原因：首先，一个miRNA可能有多个被其调控的靶基因，其发挥不同的功能取决于它所调控的靶基因，因此一种miRNA可能在一种类型的肿瘤中起着促进作用，而在另外一种类型的肿瘤中起着抑制性的作用。除此之外，miR-345的生物学功能还可能取决于肿瘤微环境，而不同的肿瘤类型有其特定的微环境。

本研究尚存在一些局限性。首先，肿瘤组织样本相对较小，还需进一步扩大样本量进行验证。其次，在本研究中我们没有在NSCLC患者血清或血浆中检测miR-345的表达变化。在血清或者血浆中检测生物标记的表达可能在临床上实时监控治疗的效果。最后，miR-345调控非小细胞发生的细胞及分子机制尚不清楚。

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(收稿：2016-10-18)

The expression and clinical significance of miR-345 in non-small cell lung cancer

HUHaifeng，FENGXiemin，QIAOJian，DUANWei，LIUNingning，SUNXiaodong

Department of Oncology，The Affiliated Hospital of Yan′an University，Yan′an 716000，China

Objective The objective of this study was to investigate the miR-345 expression level in non-small cell lung cancer(NSCLC)tissue and its potential clinical significance.Methods Real-time PCR was conducted to evaluate the expression of miR-345 in NSCLC tissues in 98 samples and cell lines.Then the association between tissue miR-345 expression level and clinical outcomes was further analyzed.Results The expression level of miR-345 was significantly decreased in NSCLC tissues and cell lines when compared to the controls(P<0.05).miR-345 expression level in NSCLS tissues was associated with various clinicopathological parameters including LN metastasis(P<0.001)，distant metastasis(P=0.028)，TNM stage(P=0.004)and grade(P=0.011).In addition，the NSCLC patients in the low miR-345 expression group showed significantly shorter overall survival time than that in the high miR-345expression group(P=0.021).Multivariate analysis showed that the expression of miR-345 was an independent risk factor for NSCLC(HR=3.897，95%CI：2.263～10.440；P=0.012).Conclusion The expression level of miR-345 was decreased in NSCLC tissues as well as cell lines compared with normal controls.Low miR-345 expression in tissues was associated with progression and poor prognosis of NSCLC.These results indicate that miR-345 may be a novel prognostic marker in NSCLC.

Biomarker；miR-345；Non-small cell lung cancer；Prognosis

延安大学附属医院肿瘤科(延安 716000)

胡海峰，男，(1983-)，硕士研究生，主治医师，从事消化道肿瘤、乳腺肿瘤、肺癌、妇科肿瘤和淋巴瘤等的研究。

胡海峰，E-mail：huhaifeng1983@126.com

R734.2

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.02.005