苁蓉提取物高效液相指纹图谱研究

吴迪，冀永东

苁蓉提取物高效液相指纹图谱研究

吴迪，*冀永东

（内蒙古昆明卷烟有限责任公司，内蒙古呼和浩特010010）

以松果菊苷为参照物，利用高效液相色谱，对苁蓉提取物进行指纹图谱分析。色谱条件为色谱柱Phenomenex Luna C18型（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相1%乙酸-乙腈，流速0.8 mL/min，检测波长334 nm。该方法精密度、重现性、稳定性均良好，共分离出12个共有色谱峰，相似度为0.993～0.999，可以作为苁蓉提取物品质控制手段。

苁蓉提取物；质控；高效液相色谱法；指纹图谱

0 引言

一直以来，香精料液生产及应用企业均将其生产工艺、配方、应用参数等视为核心技术，因而关于香精、料液品质的综合控制就显得尤为重要。基于此，如何有效鉴别香精真伪及其内在品质，控制香精、料液品质稳定性一直是生产、应用企业高度关注的问题。目前，大多数香精质控采取的都是通过监控相对密度、折光指数等一些理化指标，再结合质检人员的感官经验（人工嗅香）。这种方法只是国家为满足香精质控下限而出台的通用方法，受个人感官认知影响较大，不能从化学组成的角度对香精的差异进行全面解释，难以对香精的内在品质进行科学有效的评价控制[1]。

苁蓉提取液成分复杂，这样就造成通用质控方法适用性降低的问题[2]，有必要借助现代分析仪器、分析化学等研究成果和技术手段，实现辅助甚至提升质控水平的要求。

指纹图谱作为一种较为全面、先进的质控方法，对复杂成分的样品质控具有较强的适用性和可操作性，可以通过一个完整的、虽然“模糊”但却“专属”的色谱得到多层次的整体品质信息[3-4]。

试验以苁蓉提取物指纹图谱的建立为着手点，加强对苁蓉提取物的质量监督水平。

1 材料仪器与试剂

1.1 材料

试验共收集样品17个，满足指纹图谱样品数量大于10个的要求。

1.2 仪器与试剂

Waters 2695型高效液相色谱仪，配2998二极管阵列检测器；实验室用中药粉碎机；振荡仪（振荡频率能够达到100次/min）；活塞式移液枪：1 000，5 000 μL；容量瓶：1 000，100，50，10 mL；注射器：5 mL；0.22 μm有机相滤膜。

蒸馏水，符合GB/T 6682中一级水的要求；乙腈，色谱纯；醋酸，分析纯；松果菊苷为实验室自制，HPLC检出纯度均大于99%。

国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A版”软件。

2 结果与分析

2.1 色谱条件

色谱柱PhenomenexLuna C18型（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温25℃；进样量10 μL；波长334 nm；流动相1%乙酸（A）-乙腈（B）；流速0.8 mL/min；梯度洗脱。

梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液的制备

称取松果菊苷对照品10 mg（精确至0.01），置于10 mL容量瓶中，甲醇稀释定容至刻度，精密吸取该溶液1 mL，移入10 mL量瓶中，加甲醇稀释制成0.1 mg/mL的溶液，即得。分析过程中以其保留时间和峰面积响应为“1”，计算其他各共有峰的相对值。

2.3 供试样品的制备

准确移取4 mL苁蓉提取物于50 mL容量瓶中，流动相初始比例溶剂（1%醋酸水溶液∶乙腈=92∶8）定容，振荡10 min使分散均匀，静置10 min，液体经0.22 μm有机滤膜过滤，滤液待HPLC分析。2.4测定方法

各供试品溶液按2.1中所述色谱条件进行分离测定，记录色谱信息。以松果菊苷参照峰为标准，计算各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密性试验

取同一提取物样品，严格按照2.3中的步骤制备供试样品，连续进样5次，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值，考察仪器精密度。测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值分别为0.13%～0.77%和0.48%～2.95%，均小于3%，表明该方法精密度良好。

苁蓉提取物指纹图谱共有峰相对保留时间和相对峰面积（精密性）见表2。

表2 苁蓉提取物指纹图谱共有峰相对保留时间和相对峰面积（精密性）

2.5.2 稳定性试验

取同一供试品样品，分别在0，6，12，24，48 h检测，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值，考察试样溶液的稳定性。结果显示，所有共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3%，样品在48 h内基本稳定，表明供试品溶液在48 h内测定稳定。

苁蓉提取物指纹图谱共有峰相对保留时间和相对峰面积（稳定性）见表3。

2.5.3 重复性试验

取同一批样品5份，按要求制备供试品溶液，分别进行检测，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值分别为0.05%～0.56%和0.27%～2.28%，均小于3%，表明该方法重复性良好。

苁蓉提取物指纹图谱共有峰相对保留时间和相对峰面积（重复性）见表4。

2.6 指纹图谱分析及评价

2.6.1 不同批次苁蓉提取物指纹图谱及苁蓉提取物共有模式指纹图谱的建立

随机选取13批次的苁蓉提取物，进行唯一性标识（S1～S13），按照2.3中制备供试样品，利用高效液相色谱仪，按照2.1中所示色谱条件对样品进行检测，记录13批样品指纹图谱。将全部13个苁蓉提取液HPLC数据导入国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004（A版）”软件，生成苁蓉提取液对照图谱R，共标记出共有峰12个，7号松果菊苷为参照峰。

表3 苁蓉提取物指纹图谱共有峰相对保留时间和相对峰面积（稳定性）

表4 苁蓉提取物指纹图谱共有峰相对保留时间和相对峰面积（重复性）

苁蓉提取物HPLC指纹图谱见图1。

图1 苁蓉提取物HPLC指纹图谱

2.6.2 苁蓉提取液相似度评价

以2.6.1中生成的对照图谱R为标准，利用软件对13个批次的样品进行整体相似度评价。

苁蓉提取物指纹图谱相似度评价结果见表5。

表5 苁蓉提取物指纹图谱相似度评价结果

在此制备方法和仪器条件下，13批苁蓉提取液的指纹图谱相似度均大于0.99，说明批次间相似度良好，对照图谱确定合理，且非共有峰面积百分比小于总峰面积的10%，符合国家药典委员会对指纹图谱研究的通用要求。

2.7 苁蓉提取物样品浓度差异的评价

取同一供试样品，分别稀释1.0，0.8，0.6倍，按照2.1中色谱条件对样品进行检测，记录指纹图谱并利用软件评价相似度。结果显示，当提取液稀释至0.8，0.6倍时，相似度虽有下降但仍大于0.95，松果菊苷响应值会随着稀释度等比例下降。

样品稀释对松果菊苷响应值及相似度的影响见表6，未稀释样品松果菊苷响应值见表7。

表6 样品稀释对松果菊苷响应值及相似度的影响

表7 未稀释样品松果菊苷响应值

随机选取7个不同批次苁蓉提取物进行测定，积分结果显示，未经稀释的5个样品松果菊苷响应值相对标准偏差小于3%。这一结果一方面证明了提取物各组分比例关系稳定，同时也说明研究者需要通过对参照物的相对定量来补充相似度评价的不足。

3 讨论

（1）苯乙醇苷类化合物是肉苁蓉属药材的中药特征成分，其中又以松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量较高，通常关于苁蓉属药材的指纹图谱研究，选取这2种物质作为参照物。但不同于纯中药材研究，提取液作为中草药下游产物，除了受中药原材料品质波动影响，提取工艺以及浸提溶剂对其成分的影响也很大，这方面应予以注意。不能照搬中草药研究经验，应根据检测实际情况确定参考物质，若2种物质质量浓度较低，可以人为补偿，甚至尝试其他内标。试验在方法开发中重点考虑了松果菊苷，发现提取液中松果菊苷含量稳定，故将其作为参照物。

（2）通常情况，提取液成分受中草药原料影响较大，但肉苁蓉属中药材种类较多，包括管花肉苁蓉、草苁蓉、盐生肉苁蓉等诸多品类[5-7]，这里未做研究，只从苁蓉提取液采购及应用的角度建立现实可行的质控方法。

（3）色谱条件的选择。①色谱柱。结合苁蓉提取液样品实际情况，结合《中国药典》和文献经验，考查了150 mm和250 mm这2种不同长度的C18反相色谱柱，二者表征出的色谱峰在峰形、分离度等方面均满足指纹图谱检测要求。按照液相色谱方法开发经验和惯例，当2个色谱柱均满足检测要求时，考虑柱效及出峰速率，选择较短的150 mm色谱柱，有效采集时间65 min。②检测波长。通过验证，记录比较了254，310，330，334，345 nm等5个不同波长条件下的色谱图，结果显示330 nm与334 nm处，各峰贡献率适度，较完整地体现了供试样品化学成分的全面信息，符合指纹图谱的目标要求。波长为334 nm时前端极性物质的分离状况略好，故确定检测波长为334 nm。

（4）供试样品制备。在开发苁蓉提取液检测方法环节，由于最合适检测浓度尚未确定，在利用苁蓉提取液制备供试样品时，通过利用初始比例流动相对样品进行逐级稀释（由低到高），然后进样检测，可以避免出现样品质量浓度过高引起进样残留等问题，同时弱化溶剂差异产生的干扰。

4 结论

通过对随机抽取的13批苁蓉提取液样品指纹图谱检测与分析，各色谱峰分离良好，前段（1～20 min）、中间段（20～40 min）、末端（40～60 min）均出现明显且峰形极好的物质峰，各峰贡献率适度，较完整地体现了供试样品化学成分的全面信息，符合指纹图谱的目标要求。不同批次的苁蓉提取液内在品质存在差异，相似度存在波动。试验共确定了12个共有色谱峰，且各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3%，相似度大于0.99，方法稳定性、精密度、重现性均良好。

结果表明，结合对松果菊苷响应值的稳定性，该方法可应用于苁蓉提取液品质评价，测定简便快捷，效果良好。

[1]曾晓鹰，者为，王明锋，等.卷烟调香体系构建——以云烟品牌为例[M].成都：西南交通大学出版社，2013：57-63.

[2]张南平，肖新月，张萍，等.建立中药“对照指纹图谱”的可行性探讨[J].中国药事，2003，17（6）：347-350.

[3]周玉新.中药指纹图谱研究技术[M].北京：化学工业出版社，2002：115.

[4]张丽芳，薛飞群.中药指纹图谱的检测方法[J].广东药学，2004，14（6）：10-12.

[5]谭亚非，赵庆忠，闻家伦.肉苁蓉及其混淆品盐生肉苁蓉的紫外光谱鉴别[J].中草药，1995，18（10）：510-514.

[6]宋祖琽.肉苁蓉及其易混淆品的鉴别[J].湖北中医杂志，2002，24（2）：48-51.

[7]Jiang Y，Li S P，Wang Y T.Differentiation of Herba cistanches by fingerprint with high-performance liquid chromatograghy diode array detection mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A，2009（11）：2 156-2 162.◇

Study on HPLC Fingerprint of Liquid Material Extracted from Cistanche

WU Di，*JI Yongdong
（Inner Mongolia Kunming Cigarette Limited Liability Company，Huhhot，Inner Mongolia 010010，China）

Echinacoside is used as a reference，the liquid material extracted from Cistanche is analyzed with HPLC fingerprint. The chromatographic conditions are as follows：Phenomenex Luna C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）is used；the mobile phase is composed of acetonitrile and 1%acetic acid；the gradient elution is used at a flow rate of 0.8 mL/min and the UV absoibance detection is set at 334 nm.This method shows high precision，good repeatability and stability，12 comnlon peaks are found in the HPLC fingerprint and the similarities are between 0.993～0.999.The research can be used as a quality control method for liquid material extracted from Cistanche.

liquid material extracted from Cistanche；quality control；HPLC；fingerprint

R284

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.03.040

1671-9646（2017）03b-0047-04

2017-03-15

吴迪（1973—），女，硕士，工程师，研究方向为质量管理、卷烟配方及烟草化学分析。*

冀永东（1984—），男，硕士，工程师，研究方向为食品科学、分析化学及色谱技术。