聚酰胺-胺/纳米羟基磷灰石的合成、表征以及对牙本质小管的封闭作用

林轩东，谢方方，郝宇红，秦鹤嘉，龙金东

广西医科大学 附属口腔医院牙体牙髓科，南宁 530021



·论 著·

聚酰胺-胺/纳米羟基磷灰石的合成、表征以及对牙本质小管的封闭作用

林轩东，谢方方，郝宇红，秦鹤嘉，龙金东

广西医科大学 附属口腔医院牙体牙髓科，南宁 530021

目的 合成并表征同时具有有机、无机材料特性的纳米复合生物材料聚酰胺-胺/纳米羟基磷灰石(PAMAM/n-HAP)，并观察其对牙本质小管的封闭作用。方法 采用Pramanik水化学反应的方法制备PAMAM/n-HAP，并通过透射电子显微镜、傅里叶变换红外光谱仪对其表征和验证。最终应用PAMAM/n-HAP封闭脱矿的牙本质小管，并应用扫描电子显微镜对其修复牙本质小管的效果进行评价。结果 傅里叶变换红外光谱仪显示1244 cm-1和1650 cm-1出现了PAMAM所特有的强振动峰，同时透射电子显微镜显示n-HAP的表面出现10 nm厚的低衬度包裹层，证实了PAMAM/n-HAP的成功合成。扫描电子显微镜显示应用PAMAM/n-HAP能够有效地降低牙本质小管的直径，填充空虚的牙本质小管，封闭牙本质小管。结论 PAMAM/n-HAP作为一种新型的纳米复合生物材料具有良好的生物活性，能够借助表面的羧基与暴露的胶原纤维发生特异性结合，从而能够在较深的位置稳定封闭牙本质小管，提示PAMAM/n-HAP可能成为一种新型的脱敏材料应用于临床。

聚酰胺-胺/纳米羟基磷灰石；牙本质过敏；牙本质小管

ActaAcadMedSin，2017,39(2)：163-168

牙本质过敏被定义为暴露的牙本质受到冷、热、机械或化学刺激所产生的短暂而尖锐的疼痛，并且牙本质过敏不能够单纯归入到牙体缺损或病理性疾病的类别[1]。牙本质过敏通常是由酸蚀、磨损或磨耗、牙龈退缩以及牙周治疗等引起。1960年最先提出的流体动力学学说认为正是因为暴露的牙本质小管受到刺激引起牙本质小管液的流动最终引起疼痛。基于此原理，目前临床使用的脱敏材料大多是应用无机材料，例如氟化物[2]、草酸盐[3]等,通过单纯机械沉积作用封闭牙本质小管。近年来，纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite，n-HAP)/聚合物生物复合材料因同时具有有机材料和无机材料的优点而成为骨修复材料的新的热点[4]。本研究初步探讨人工合成的聚酰胺-胺(polyamidoamine dendrimers，PAMAM)/n-HAP纳米复合生物材料对牙本质小管的封闭作用。

材料和方法

PAMAM/n-HAP纳米复合生物材料的制备 1 g表面官能团为羧基的聚酰胺-胺树枝状高分子(PAMAM-COOH，美国Sigma公司)慢慢溶解于100 cm3的三蒸水中，并使用磁力搅拌器(双数显恒温磁力搅拌器 85- 2B，江苏省金坛市友联仪器研究所)搅拌30 min以确保PAMAM-COOH完全溶解。之后，6 g n-HAP(60 nm，上海华蓝化学科技有限公司)逐步加入至PAMAM-COOH溶液中，并使用磁力搅拌器搅拌过夜。最后使用大功率超声设备(KQ5200V超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司)对此混合物进行超声振荡处理30 min。终产物通过过滤分离并使用双蒸水清洗3次去除游离的PAMAM-COOH，最后置于50℃的真空干燥箱过夜。

PAMAM/n-HAP 纳米复合生物材料的表征 用透射电子显微镜(H- 7650，HI TACHI)在100 kV的加速电压条件下测试n-HAP晶体形貌和改性n-HAP形貌 。同时使用傅里叶变换红外光谱仪(美国PerkinElmer公司) 对复合材料的有机无机相键合进行表征。

脱矿牙本质模型的制备：获得患者的知情同意后，搜集广西医科大学口腔颌面外科因正畸需要而拔除的新鲜第三磨牙90颗，经显微镜观察，无白斑、无缺损、无龋坏，使用医用刀片去除表面的软组织，并使用3%的次氯酸钠去除牙齿表面的细菌，最终浸泡于4℃条件下0.05%的麝香草酚溶液中，于拔牙后1个月内使用。本研究采用Mordan等[5]的实验方法制备牙本质脱矿模型。用高速涡轮机的金刚砂车针在水冷的条件下,将各离体牙均以垂直于牙体长轴方向于釉牙骨质界冠方2～3 mm处切割4 mm×4 mm×1 mm大小的牙本质磨片，每颗牙制备1个。使用600、800、1000目的碳化硅砂纸逐级打磨抛光。抛光后的牙本质磨片浸泡于0.5 mo1/L的EDTA(pH 8.0)脱矿30 min。每个脱矿后使用去离子水冲洗3次,并且使用大功率超声设备震荡10 min以去除游离的矿化物，制备完成的脱矿牙本质磨片浸泡于PBS缓冲液(武汉博士德生物工程有限公司)中，4℃保存。

人工唾液的配制：按照Fusayama等[6]的实验方法：Na2S·9H2O 0.005 g、NaCl 0.400 g、KCl 0.400 g、NaH2PO4·H2O 0.690 g、CaCl2·H2O 0.795 g、蒸馏水1000 ml，在使用前使用1 mo1/L的NaOH将其pH值调节至7.2，高温高压灭菌后保存。

牙本质小管的封闭实验：(1) 对照组A(n=10)：牙本质磨片使用微量移液器(大龙医疗设备有限公司)将25 μl去离子水处理实验面，加入到牙本质磨片表面后，使用一次性牙科小毛刷涂抹5 min/次，共2次/日，连续处理7 d后保存于37℃的人工唾液中。(2) 实验组B(n=10)：牙本质磨片使用微量移液器将25 μl PAMAM/n-HAP糊剂(0.5 g PAMAM/n-HAP与1 ml去离子水调配制成)加入到牙本质磨片表面后，使用一次性牙科小毛刷涂抹5 min/次，共2次/日，连续处理7 d后保存于37℃的人工唾液中。(3) 实验组C (n=10)：牙本质磨片使用25 μl n-HAP糊剂(0.5 g n-HAP与1 ml去离子水调配制成)处理实验面，加入到牙本质磨片表面后，使用一次性牙科小毛刷涂抹5 min/次，共2次/日，连续处理7 d后保存于37℃的人工唾液中。每次处理后，牙本质磨片静置5 min并使用去离子水冲洗2 min。最后每个样本置于含有5 ml 人工唾液的密封PE管中，并保存于37℃恒温水浴箱(上海蓝豹实验仪器有限公司)。人工唾液每24小时更换1次。

扫描电子显微镜 观察3组的样本经过7 d的封闭实验后，使用扫描电子显微镜(Hitachi，SU8020，10 KV，USA)观察脱矿牙本质磨片的封闭作用。扫描电镜表征前，每个牙本质磨片使用去离子水冲洗2 min并置于50℃条件的真空干燥箱24 h彻底干燥，每组随机选择4个牙本质磨片喷金后在10 kV的加速条件下观察横断面以及纵断面的牙本质小管的形貌特征和微观结构。

结 果

n-HAP以及PAMAM/n-HAP晶体形貌的透射电子显微镜观察结果 在200 000倍的透射电子显微镜表征下，n-HAP晶体为短棒状，直径 20～30 nm，长度为60～80 nm，多数晶体颗粒容易聚合呈团簇状，n-HAP的界面清晰，而PAMAM/n-HAP纳米复合生物材料的表面可以看到约为10 nm厚的低衬度有机分子层有序地包裹着n-HAP(图1)。

n-HAP：纳米羟基磷灰石；PAMAM：聚酰胺-胺n-HAP：nano-hydroxyapatite；PAMAM：polyamidoamine dendrimers

图 1 n-HAP(A)和PAMAM/n-HAP(B)的透射电镜图(× 200 000)

Fig 1 Transmission electron microscopy photographs of n-HAP (A) and PAMAM/n-HAP (B)(×200 000)

图 2 n-HAP、PAMAM/n-HAP 纳米复合生物材料的红外光谱图

Fig 2 Fourier transform infrared spectroscopic spectra of n-HAP and PAMAM/n-HAP

牙本质小管的横断面扫描电子显微镜观察结果 对照组A基本所有的牙本质小管均为暴露状态，牙本质小管的直径并无明显的缩窄。实验组B几乎所有的牙本质小管均被致密的棒状成簇的外源性晶体(PAMAM/n-HAP)所封闭，牙本质小管的边界不清，高倍电镜图(×25 000)显示牙本质小管内均一致密的封闭晶体出现不规则的断裂痕迹，可能由于真空干燥箱的高温作用引起的脱水膨胀断裂引起。实验组C牙本质小管口发现不规则的晶体沉积物，然而牙本质小管的直径并无明显的缩窄，管内仍然空虚，高倍镜下(×25 000)牙本质小管内壁的胶原纤维表面可见棒状晶体沉积，同时小管深处也可见部分沉积封闭的矿化物，但是管腔内大部分空间仍然敞开(图3)。

讨 论

图 3 去离子水[A1(×2000)、 A2(×3000)、A3 (×25 000)]、PAMAM/HAP [B1(×2000)、 B2(×3000)、 B3(×25 000)]、n-HAP [C1(×2000)、C2(×3000)、C3 (×25 000)]处理7 d后的扫描电镜图

Fig 3 Scanning electron microscopic micrographs of the surface of dentin treated with deionized water [A1(×2000)，A2(×3000)，A3(×25 000)]，PAMAM/HAP [B1(×2000)，B2(×3000)，B3 (×25 000)]，n-HAP [C1(×2000)，C2(×3000)，C3 (×25 000)]after 7 days

A.去离子水处理7 d后的纵断面电镜图(×1000)；B. PAMAM/n-HAP处理7 d后的纵断面电镜图 (×1000)；C. n-HAP处理7 d后的纵断面电镜图 (×1000)

A. vertical morphology of the surface of dentin treated with deionized water after 7 days (×1000)；B. vertical morphology of the surface of dentin treated with PAMAM/n-HAP after 7 days (×1000)；C. vertical morphology of the surface of dentin treated with n-HAP after 7 days (×1000)

图 4 牙本质样本纵断面形貌

Fig 4 The vertical morphology of dentin samples

总之，PAMAM/n-HAP作为一种新型的具有生物活性的纳米材料，能够通过表面的羧基官能团规律地结合并且稳定到牙本质小管内部暴露的胶原纤维表面，从而封闭暴露的牙本质小管。单纯依靠机械沉积作用的材料(n-HAP)虽然能够借助尺寸优势进入到牙本质小管内部，但是其与胶原纤维没有实质性的结合作用，仅通过机械沉积作用不能够稳定地封闭牙本质小管，在去离子水的冲洗作用下，n-HAP颗粒容易游离从而造成牙本质小管的不完全封闭作用。

目前，多种材料改性的n-HAP大多数应用于修复骨缺损，而本研究采用PAMAM与n-HAP结合形成的PAMAM/n-HAP材料应用于修复脱矿牙本质小管。本研究表明在n-HAP的表面通过添加PAMAM树枝状大分子，明显增强了生物活性，从而稳定地封闭开放的牙本质小管。综上，PAMAM/n-HAP纳米复合生物材料具有良好的牙本质小管封闭作用，因此有望作为一种新型的脱敏材料应用于临床，并可能成为口腔医学领域最具开发价值的新材料之一。后期本课题组的研究将着重比较PAMAM/n-HAP纳米复合生物材料与目前临床应用的脱敏剂的封闭效果差异。

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Synthesis and Characterization of Polyamidoamine Dendrimers/Nano-hydroxyapatite and Its Role in Dentin Tubule Occlusion

LIN Xuandong，XIE Fangfang，HAO Yuhong，QIN Hejia，LONG Jindong

Department of Endodontics，Affiliated Stomatological Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

Corresponding author：XIE Fangfang Tel：0771- 2387834，E-mail：linxuandong@live.com

Objective To synthesis and characterization nano-composite biomaterials-polyamidoamine dendrimers/nano-hydroxyapatite (PAMAM/n-HAP)，which has the properties of both organic and inorganic materials，and then evaluate its role in dentin tubule occlusion. Methods PAMAM/n-HAP was characterized and validated by Fourier transform infrared spectrometry and transmission electron microscopy after its preparation via the Pramanik aqueous-based chemical method. Scanning electron microscope was used to evaluate its role in dentin tublule occlusion. Results The peak absorption bands were found at 1244 cm-1and 1650 cm-1in Fourier transform infrared spectroscopy. A relatively low-density coating (about 10 nm) appeared on the n-HAP. The results of Fourier transform infrared spectrometry and transmission electron microscopy confirmed the successful synthesis of PAMAM/n-HAP. The scanning electron microscope showed that PAMAM/n-HAP could effectively reduce the diameter of the dentin tubule and close dentin tubule. Conclusions PAMAM/n-HAP，as a newly synthesized biomaterial，has a good binding capacity with collagen fibers with the help of superficial carboxyl. It can induce effective dentinal tubule occlusion，indicating that PAMAM/n-HAP have great potential in clinical practice for dentin hypersensitivity.

polyamidoamine dendrimers/nano-hydroxyapatite；dentin hypersensitivity；dentin tubule

谢方方 电话：0771- 2387834，电子邮件：linxuandong@live.com

R781.1

A

1000- 503X(2017)02- 0163- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.02.001

2016- 09- 28)