青钱柳多糖对高脂血症小鼠SOD、GSH—Px、CAT基因mRNA表达的影响

赵静+吴茹+李楠+杨占威+胡文兵+王文君

摘要：为研究青钱柳多糖对高脂血症小鼠抗脂质过氧化相关基因表达的影响，将建模成功的高脂血症小鼠随机分为青钱柳多糖高、中、低剂量组，辛伐他汀组，高脂模型组和空白对照组，其中前4组分别灌胃400、200、100 mg/kg青钱柳多糖水溶液，4 mg/kg辛伐他汀水溶液，另2组灌胃等量无菌水，每组16只，连续喂养4周。试验结束后采用逆转录PCR（RT-PCR）测定肝脏、脂肪组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）基因的mRNA表达水平，探讨青钱柳多糖抗脂质过氧化机制。结果表明，不同剂量青钱柳多糖可使SOD、GSH-Px、CAT mRNA表达量显著或极显著上升（P<0.05或P<0.01），其中肝脏组织中SOD、CAT表达量最大增幅分别达1309%、108.6%，GSH-Px表达量未出现显著变化；脂肪组织中SOD、GSH-Px的最大上调幅度分别为507%、1000%，而CAT表达量无显著差异。结果显示，青钱柳多糖可调节高脂血症小鼠抗氧化相关基因的表达，增强其机体抗脂质过氧化能力。

关键词：青钱柳；多糖；脂质过氧化；高脂血症；mRNA表达

中图分类号： S188文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）04-0124-04

随着经济快速发展及人民生活水平的提高，肥胖已成为人们面临的一个重要健康问题，高脂、高蛋白食物的过多摄入，导致人体脂质代谢异常，脂质过氧化程度加重。高脂、高蛋白食物消化产物可引起细胞的功能损伤并伴随多种疾病的发生，如心血管疾病、癌症、动脉粥样硬化等[1]。目前，降血脂仍主要依赖于他汀类药物，其副作用日益被人们关注，因此，研究开发天然无毒、无副作用的植物提取物作为抗脂质过氧化的功能性食品药品显得格外重要。已有研究发现，植物中分离得到的多糖类化合物能够清除体内自由基，抑制亚油酸氧化，具有防止细胞脂质过氧化的作用[2]。青钱柳[Cyclocarya paliurus （Batal） Iljinskkaja]别称青钱李或金钱柳，系胡桃科青钱柳属落叶乔木，该属现仅存1种，且仅存于我国，是我国濒临绝种的珍稀树种之一，已于2013年被纳入我国新食品原料。青錢柳中含有人体所需的胡萝卜素、维生素E、维生素C、蛋白质和人体必需氨基酸等多种成分，在民间已被制作为一种保健茶饮用。此外，青钱柳还含有对人体健康有积极意义的大量、微量元素[3]，已有研究表明，青钱柳多糖具有降血糖、降血脂、降血压、抗氧化、提高免疫力等作用[4]，然而关于青钱柳多糖抗脂质过氧化的分子机制鲜有报道。

笔者所在实验室前期研究表明，青钱柳多糖可通过调节高脂血症大鼠脂代谢相关基因的表达，降低血脂水平[5]；同时，青钱柳多糖在体内、体外也有明显的抗氧化作用，可清除羟基自由基、对二苯代苦味酰基自由基（DPPH·），并能够显著提高高脂血症小鼠肝脏超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，简称SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，简称GSH-Px）活性，降低丙二醛（malondialdehyde，简称MDA）、游离脂肪酸（nonestesterified fatty acid，简称NEFA）含量[6]。本试验在前期研究基础上采用逆转录PCR（RT-PCR）测定抗氧化相关基因SOD、GSH-Px、过氧化氢酶（catalase，简称CAT）在肝脏、脂肪细胞中的表达水平，在分子水平上进一步探讨青钱柳多糖的抗氧化机制，以期为青钱柳多糖的开发、利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验动物本研究所用试验动物为120只出生21d的雌性昆明种小鼠，体质量18～22 g[合格证号：SY（赣）2010-0002]，购自南昌大学医学部实验动物中心，小鼠饲养环境温度（23±2） ℃，相对湿度（55±5）%，光照时间12h/d（光照时间范围：07：00—19：00）。

1.1.2药物、试剂和仪器青钱柳叶采用水提醇沉法提取多糖[6]，经D301R树脂纯化后，测得多糖含量为60.71%；全价饲料，由南昌大学医学部实验动物中心提供。辛伐他汀胶囊，上海云峰药业有限公司；总胆固醇（TC）测定试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司；焦炭酸二乙酯（DEPC），美国Amresco公司；琼脂糖，美国Promega公司；2×Taq PCR Master Mix，美国BEST ALL公司；RNase喷雾清除剂、TRIzol试剂盒、RT-PCR试剂盒，北京全式金生物技术有限公司；PCR引物，生工生物工程（上海）股份有限公司。其他试剂均为分析纯。

主要仪器：PE9600 PCR仪，PERKIN ELMER公司；GeneGenius全自动数码成像及分析系统，SYNGENE公司；移液器、5415D型小型高速离心机，德国Eppendorf公司；超微量分光光度计，美国Thermo Scientific公司。

1.2试验方法

1.2.1高脂血症小鼠建模与给药本试验高脂乳剂配制方法见文献[6]，120只小鼠适应性喂养1周后随机分成空白对照组（20只）、模型组（100只）。每天09：00模型组灌胃高脂乳剂（1 mL/kg），空白对照组灌胃等体积的无菌水，其间自由饮水摄食。灌胃2周后，禁食、不禁水12 h，眼眶静脉采血，测定小鼠血清总胆固醇含量。模型组小鼠血清TC值与空白对照组相比差异极显著（P<0.01）视为建模成功，选取80只造模成功的小鼠，随机分高脂模型组、对照组与青钱柳多糖低、中、高剂量组和辛伐他汀组，每组16只。除空白对照组外，其余5组小鼠每天9：00灌胃高脂乳剂（1 mL/kg），16：00青钱柳多糖低、中、高3组分别以100、200、400 mg/kg青钱柳多糖水溶液灌胃，高脂模型组、对照组灌胃等体积的无菌水，阳性对照组（辛伐他汀组）灌胃辛伐他汀水溶液4 mg/kg。连续灌胃4周，每周称量1次体质量，以调整给药剂量，试验期间各组小鼠均自由饮水摄食。

1.2.2RNA的提取、逆转录和RT-PCR试验结束后，禁食、不禁水12 h，乙醚麻醉后迅速解剖小鼠，取肝脏、腹腔脂肪放入液氮速冻，于-80 ℃保存备用。

总RNA的提取：参照TRIzol试剂盒说明书提取各组小鼠肝脏和腹腔脂肪总RNA，经超微量紫外分光光度计测定，D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之间，电泳检验完整性符合下游试验要求。

逆转录合成cDNA。按照试剂盒要求配制逆转录体系：5～500 ng总RNA、10 μL 2×ES Reaction Mix、1 μL Anchored Oligo（dT）18 （0.5 μg/μL）、1 μL EasyScriptTM RT/RI Enzyme Mix，补充脱RNase水至20μL。轻轻混匀此反应体系，42 ℃ 孵育30 min，85 ℃加热5 min灭活逆转录酶。取出 1 μL cDNA 测定其浓度，剩余cDNA保存于-20 ℃或立即用于PCR。

RT-PCR：登录GenBank查找SOD、GSH-Px、CAT、β-肌动蛋白（β-actin）基因序列，用DNAMAN（Version 3.0）设计所需引物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，相关引物序列信息见表1。PCR反应体系：1 μL cDNA，各05 μL上、下游引物，12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，补充双蒸水至25 μL。反应条件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，61 ℃（SOD、GSH-Px、CAT基因）30 s，59.3 ℃（β-actin基因）30 s，72 ℃ 30 s，34次循环。

1.2.3凝胶成像分析及数据分析RT-PCR扩增结束后，分别取各组SOD、GSH-Px、CAT PCR产物电泳[条件为15%琼脂糖凝胶（含0.05%溴化乙锭），1×TAE（成分为三羟甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸）电泳缓冲液，80 V电泳 1 h]，用凝膠图像分析软件（Gene Tools Analysis）进行光密度扫描半定量分析，目的基因的相对表达量以该基因和[JP2]β-actin 电泳带于260 nm的吸光度比值表示。设空白对照组mRNA吸光度为1，计算其他各试验组mRNA相对吸光度比值。试验数据用DPS统计软件（V3.01专业版）统计分析，结果以“平均值±标准差”（x[TX-*5]±s）表示，P<0.05视为差异显著。[JP]

2结果与分析

2.1青钱柳多糖对高脂血症小鼠肝脏和脂肪组织中SOD mRNA表达的影响[HT]

在通常情况下，生物体内的自由基处于动态平衡，当此平衡被打破后，将引发许多相关疾病。SOD、GSH-Px、CAT常被用作重要的抗氧化指标，它们的协同作用维持了机体自由基的动态平衡，可以阻止脂质过氧化和此过程中的中间产物对机体造成的损害。SOD是生物体内重要的抗氧化酶之一，通过催化超氧化物转化为过氧化氢、氧气而达到抗氧化作用，在维持生物体自由基产生、平衡过氧化物清除能力上起重要作用[7]。Zeng等报道，L-苹果酸可提升大鼠肝脏细胞中SOD mRNA的表达量[8]。Fer[KG-*5]n[DD（-1*2][HT6]′[DD）]andez-Iglesias等发现，在葡萄籽原花色素提取物和富含二十二碳六烯酸（DHA）的水藻提取物混合作用下，大鼠SOD活性、肝脏SOD表达量显著提高[9]。

设正常对照组小鼠脂肪中SOD mRNA表达吸光度为1，计算其他各组mRNA表达相对吸光度。由表2、图1可知，在肝脏中，与空白对照组相比，高脂模型组小鼠肝脏中SOD mRNA表达量下降45.0%（P<0.05）；与高脂模型组相比，青钱柳多糖高剂量组、中剂量组、辛伐他汀组小鼠肝脏中SOD mRNA表达量显著或极显著升高（P<0.05或P<0.01），上升率分别为130.9%、527%、56.4%，此外低剂量组也上升40.0%。在脂肪中，与空白对照组相比，高脂模型组小鼠脂肪中SOD mRNA表达量下降330%，差异极显著（P<0.01）；与高脂模型组相比，青钱柳多糖高剂量组、中剂量组、低剂量组、辛伐他汀组小鼠脂肪中SOD mRNA表达量分别上升了50.7%、38.8%、104%、23.9%，且高剂量和低剂量组与之差异显著（P<005）。结果表明，青钱柳多糖可通过调节SOD mRNA的表达量提高抗氧化能力。

2.2青钱柳多糖对高脂血症小鼠肝脏中GSH-Px mRNA表达的影响[HT]

作为一种重要的催化氧化酶，谷胱甘肽过氧化物酶广泛分布在细胞质、线粒体内， 不仅能清除生物体内自由基，还能

阻断脂质过氧化链式反应，保护细胞膜的结构和功能不被破坏[10]。Han等研究发现，2种富含花青素的紫薯提取物可显著提高大鼠肝脏中GSH-Px的表达水平，从而抑制肝脏中脂质过氧化的发生[11]；另外有研究显示，在红茶提取物干涉下，秀丽隐杆线虫细胞中GSH-Px的活性增加，其mRNA表达水平也显著上升[12]。设空白对照组小鼠组织中GSH-Px mRNA 表达吸光度为1，计算其他各组mRNA表达相对吸光度。由表3、图2可见，在肝脏中，与空白对照组相比，高脂模型组小鼠GSH-Px mRNA表达量升高4.2%；与高脂模型组相比，青钱柳多糖高剂量组、中剂量组、低剂量组及辛伐他汀组小鼠肝脏中GSH-Px mRNA表达量没有显著性差异，随着

2.3青钱柳多糖对高脂血症小鼠CAT mRNA表达的影响

过氧化氢酶又称触酶，是生物防御体系中重要的末端氧化酶。CAT主要作用是清除生物体内的过氧化氢，它以过氧化氢为底物，催化1对电子的转移，将其最终分解为水、氧气，进而阻止对机体有害的羟基自由基生成[13]。已有研究发现，迷迭香提取物可以提高高脂膳食小鼠肝脏中CAT mRNA的活性和表达水平，并减少脂质过氧化产物[14]。

设空白对照组小鼠肝脏中CAT mRNA表达吸光度为1，计算其他各组mRNA表达相对吸光度。由表4、图3可见，在肝脏中，与空白对照组相比，高脂模型组小鼠肝脏中CAT mRNA 表达量下降42.0%（P<0.05）；与高脂模型组相比，青钱柳多糖高剂量组、中剂量组、低剂量组、辛伐他汀组小鼠肝脏中CAT mRNA表达量分别提高了108.6%、89.7%、241%、41.4%，其中高剂量组肝脏中CAT mRNA表达量较高脂模型组极显著提高（P<001）。在脂肪中，与空白对照组相比，高脂模型组脂肪中CAT mRNA下降6.0%；与高脂模型组比较，青钱柳多糖高剂量组、中剂量组、低剂量组、辛伐他汀组CAT mRNA表达量提高幅度分别为39.4%、39.4%、106%、287%。结果说明，青钱柳多糖可影响CAT在肝脏中的表达，调节机体抗脂质过氧化能力，在脂肪组织中各组CAT mRNA的表达量未出现显著差异，出现这种现象可能是因为CAT主要存在于动物的肝脏、红细胞中，在脂肪中表达

3结论

本研究发现，青钱柳多糖能顯著提高小鼠SOD、GSH-Px、CAT基因的表达量，从而提升体内抗氧化酶的活性和清除自由基的能力，在分子水平上解释了青钱柳多糖抗脂质过氧化的可能的机制，可为青钱柳的开发提供理论依据。

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