新疆棉花黄萎病菌生理型鉴定

陈民志 +张海萍++曲延英 +朱荷琴++叶武威++马前程++刘莎++聂梦颖++顾爱星

摘要：通过分离、培养新疆南疆、北疆若干地点采集棉株中的黄萎病菌，对不同抗病性的棉花有效接种黄萎病菌，采用鉴别寄主法和特异性引物PCR检测技术来确定棉花黄萎病菌的类型。得出菌株44-138在30个棉花品种上均表现强的致病力。

关键词：棉花黄萎病；生理型；培养性状；鉴定法

中图分类号：S435.621.2+4文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2017）04-0070-03

棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae Kleb.）是一种典型的土传植物维管束病害，在世界各主要植棉区均有发生，并呈日益蔓延的趋势，严重影响我国主产区新疆棉花的产量与安全[1]。姚耀文等研究表明，新疆和田及车排子菌，生理型2号，致病力最弱[2]。2000年前，新疆没有落叶型黄萎病菌菌系的报道[3]。2004年，张莉等从南北疆各主要植棉区采样进行检测，发现在南北疆已存在落叶型菌系，但数量很少[4]。2004年，段维军等采用营养亲和群和分子生物学的方法，再次证实新疆存在落叶型黄萎病菌菌系[5]。根据2008—2009年对棉花枯萎病、黄萎病的调查，近年来，棉花黄萎病的发生日益严重，重病田明显增多，急性枯死型症状不断出现，给当地农业生产带来极其严重的损失[6]，培育抗病品种是目前防治棉花黄萎病的有效措施，抗病育种需要明确棉花黄萎病菌的生理型、致病性分化和简易、准确的鉴定方法。

本研究通過分离、培养新疆南疆、北疆若干地点采集棉株中的黄萎病菌，对不同抗病性的棉花有效接种黄萎病菌，鉴定棉花黄萎病抗病性，探明棉花黄萎病菌生理型的简易、准确鉴定方法，为棉花抗病性研究提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1棉花品种

共30份抗病性不同的棉花品种（系）。抗病品种（系）：新海16号、新陆早26号、中棉所35号、中棉所12号、中棉所17号、爱字棉、军海1号、新海20号、中棉所19号、新陆早12号；耐病品种（系）分别为新陆早48号、辽棉18号、新陆早11号、冀668、川737、新陆中42号、新陆早42号；感病品种（系）分别为新陆早1号、新陆早36号、大铃棉、老炮台、108夫、F2、硕丰1号、新陆早13号、苏K202、新陆早35号、新陆早16号、新陆早50号。对照为感病品种军棉1号。所有棉花品种（系）均来自新疆农业大学农学院植物育种系。

1.1.3供试棉花黄萎病菌

以落叶型棉花黄萎病菌株V76、V991为对照，对照菌株由美国南部平原棉花研究所及南京农业大学提供。

1.2方法

1.2.1分离棉花黄萎病菌的方法

挑出发病棉株，留茎下部，洗净去皮，擦干，切成1～3 mm小块，用于无菌操作；在超净工作台，将切好的病棉小块材料先后置于2%的次氯酸钠、75%乙醇和无菌水中各泡1～2 min，用无菌纸拭干，移入含0.01%链霉素的PDA培养基，置于25 ℃恒温培养箱培养；待菌株长出，进行纯化、镜检、培养性状观察；置于-4 ℃冰箱中待用。

1.2.2鉴别寄主法

1.2.2.1棉苗培育

挑选饱满的棉种进行催芽处理，待种芽长度达到1 cm时播种[7]。将催芽后的棉花种子种植在装有灭菌土的无底塑料钵中，每钵种植6粒种子，每个品种10钵，播种后将营养钵置于托盘内，托盘中灌满清水，放置在人工气候箱中培养，光照12 h，温度27 ℃；黑暗12 h，温度 22 ℃[8]。棉种出苗后，每个营养钵中留棉苗3株，待2张真叶展平时接菌[9]。

1.2.2.2接种黄萎病菌孢子液的制备

将分离培养的菌种在PDA平板上活化3 d后，用打孔器在菌落上打孔，挑取5～6块菌丝块放置液体PDA培养基中，于26 ℃下静置培养3 d后，挑取液体培养基表面的菌丝。转接到营养较少的液体PDA培养基中，放在20 r/min、26 ℃的摇床里培养，7 d后用4层纱布过滤，在显微镜下用血球计数板将孢子浓度调至 2×107个/mL，现配现用。本研究采用营养较少的PDA培养基配方为马铃薯50 g、蔗糖5 g、蒸馏水1 000 mL。

1.2.2.3棉苗接种

采用接种方法为切根蘸菌法，用灭菌后的剪刀在塑钵的底部将棉苗的须根剪掉，然后放在盛有 30 mL 孢子悬液的培养皿中泡10 min，然后放回托盘中。7月19日挑选饱满的棉种，用30%的H2O2冲洗3次，最后1次浸泡5 h后，用无菌水冲洗2～3遍，最后用无菌水浸泡12 h，将土于高压蒸汽锅中灭菌；7月20日播种于直径10 cm、高 10 cm 的有底塑料钵中，土下3～5 cm位置，7月27日长出2片真叶，每钵留3株，将棉花黄萎病菌孢子浓度调至 2×107个/mL，将棉株剪去底根放入其中泡10 min，然后放回托盘中，每2 d浇水1次、记录1次，15 d后开始零星发病，9月10日调查。

1.2.2.4抗病性鉴定

当感病对照的病情指数达50左右时，按全国统一标准调查不同品种的发病情况。采用相对病情指数来划分抗病类型。先用50.0除以本期感病对照实际病情指数，计算校正系数K值。为保证鉴定结果的准确性，要求K值范围0.75～1.25。然后将供试品种实际病情指数乘以K值，即为相对病情指数（表2）

计算公式：

[JZ]发病率=病苗总数/调查总数苗×100%。

病情指数=ε（发病级值×该级病叶数）/（最高发病级值×调查总叶数）×100%。

[JZ]相对病情指数（In）=K×鉴定品种的实际病指[2]。

K值的计算：

[JZ]K=50.00/DI。

式中：K表示校正系数；50.00表示感病对照标准综合评价病情指数；DI表示本次鉴定感病对照综合评价病情指数。

接种后每隔2 d记录1次感病情况，播种50 d后，将棉苗全部削茎检查，根据病情，分级记载（表3）。

1.2.3PCR鉴别方法

1.2.3.1DNA的提取

各供试菌系在PDA平板上25 ℃培养15 d，采用天泽基因工程有限公司生产的柱式土壤DNA out试剂盒，按照说明书操作提取DNA，将其保存在-20 ℃冰箱中备用。

1.2.3.2引物合成

PCR特异性引物选用Pérez-Artés等设计的检测棉花黄萎病菌落叶型（D1/D2）、非落叶型（ND1/ND2）的2对特异性引物[14]，扩增片段大小分别为 550、1 500 bp。

1.2.3.3PCR反应体系及扩增条件

PCR反应体系：10×buffer（含Mg2+）2.5 μL、200 μmol/L dNTP、0.5 umol/L各引物、1 U Taq DNA polymerase、模板1 μL，总体积25 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸 2 min，34个循环；72 ℃延伸10 min。

1.2.3.4PCR产物的电泳检测

PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后将琼脂糖凝胶置于含有0.5 μg/mL EB的染液中染色15 min，然后置于凝胶成像仪上观察并扫描于计算机软件中保存。

1.2.3.5统计分析

采用Excel 2007对数据进行初步处理，然后利用SPSS 18.0软件分析黄萎病相对病情指数与产量性状指标间的相关关系。

2结果与分析

2.1分离得到的棉花黄萎病菌

定出棉花黄萎病的致病性，对病情的防治有着重要意义。关于棉花致病性常见的检测方法有温室致病性测定、菌落培养性状比较和分子检测等方法，棉花黄萎病菌生理型的鉴定主要通过接种病原菌后的鉴别寄主抗感反应型进行划分[15]。本试验通过鉴别寄主法得到棉株对菌株44-138的平均相对感病系数为41.4。郭景红等对近5年新疆审定通过的新陆早系列棉花品种抗黄萎病进行鉴定，新审定棉花品种抗黄萎病性较弱，仅有28%的品种鉴定抗病，32%的品种鉴定感病[16]；邰红忠对近几年新疆南部棉区示范和试种棉花品种进行了黄萎病抗病性鉴定，耐病品种占黄萎病鉴定材料的2143%，没有抗病材料[17]。本试验通过鉴别寄主法得到30个棉花品种（系）对菌株44-138仅有20%的品种（系）鉴定耐病，80%品种（系）鉴定感病，与前人研究结果一致。2004年，张莉等从南疆、北疆主要植棉区采样进行检测，发现在南疆、北疆已存在落叶型菌系，但数量很少[4]。本试验验证了该结论。现在南疆、北疆都存在落叶型菌系，具体分布、致病力、生理型都不明确，还有待进一步研究分析。

从南疆、阿克苏16团采样地点的感病棉株中分离出 N-2、AKS16菌株，分离率分别为40.0%、12.5%。北疆石河子122团、132团分离出了81-4、44-138菌株，分离率分别为50%、25%。从中选出44-138菌株进行鉴别寄主法鉴定，得出棉株平均相对感病系数为41.4，且每个棉株的相对感病系数都大于30.1，所以44-138菌株属强致病力菌系，生理型属生理I型。

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