籼稻复交F1花药培养力的提高技术

刘凯+唐红生+严国红+孙明法

摘要：以MS培养基为对照，研究分析M8和N6等2种培养基在不同激素浓度条件下，籼稻复交F1花药的培养力。结果表明，在只添加2 mg/L 2，4-D的诱导培养基上，M8培养基可以使籼稻复交F1花药出愈率达23.97%～38.28%，而N6培养基只有10.77%～19.61%；在M8诱导培养基上，激素配比为2 mg/L 6-BA、0.5 mg/L KT、2 mg/L ABA，花药出愈率最高可达55.57%，在M8分化培养基上，激素配比为2 mg/L 6-BA、1 mg/L NAA、1 mg/L IAA的培养基能使籼稻复交F1的分化率达到44.97%，因此不同激素配比下的M8培养基更适应于籼稻F1花药培养，这为建立高效的籼稻F1花药培养技术体系提供了依据。

关键词：籼稻；复交F1；花药培养力；诱导；分化；培养基；激素；出愈率

中图分类号： S511.2+10.43文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）04-0047-02

花药培养是一种单倍体育种技术，目前已经成功应用于水稻育种中的各个领域，它具有缩短育种周期、提高选择效率、快速创新种质等诸多优势，但植物组织培养存在很强的物种依赖性和基因型特异性。目前，水稻花药培养效率尤其是籼稻的平均出愈率一般不超过5%，绿苗率大多在20%以下，因此水稻基因型的狭窄和组织培养的低效率极大地限制了水稻花药培养在生产上的利用[1]。

[JP2]一般认为粳稻培养效率较高，籼粳杂交后代居中，目前以籼粳杂交F1的花药作为中间型材料在花药培养技术上得到了广泛的应用。王建平等认为，利用广亲和品种与其他籼粳品种杂交的F1或其本身花培效率都较好[2]，并且F1结实率高，在花培后代出现农艺性状优良的个体机率较大[3]。陈成斌等研究发现，杂交组合中若含有粳稻血缘，则花药培养力较高，较易获得大量的花培绿苗，因此花培育种中常以粳稻作为桥梁亲本[4]。相关的研究大大推进了以组织培养为基础的水稻育種工作，但目前关于籼稻复交F1花药培养力的研究比较少见。[JP]

本试验在以往研究的基础上，以4个籼稻复交F1组合为试验材料，利用M8和N6为基本培养基重点研究不同浓度的植物激素类物质，对不同籼稻复交F1花药愈伤组织的诱导和分化的影响，试图进一步优化上述水稻复交F1高效花药培养的技术体系。

1材料与方法

1.1供试材料[HT]

4个籼稻杂交组合F1均来自江苏沿海地区农业学研究所水稻室。（镇42/中728）//02428、（中4188/明77）//02428、（559/075）//矮杆、（084/129）//矮杆，材料种植于江苏沿海地区农业科学研究所南洋试验场，2013年5月10日播种，6月10日移栽，田间管理按常规方法。

1.2培养基

1.2.1诱导培养基

采用MS、M8和N6培养基，M8配方参照文献[5]，N6配方参照文献[6]，其中均附加30 g/L蔗糖、8 g/L 琼脂粉、2 mg/L 2，4-D（2，4-苯氧乙酸）、0.5 mg/L水解络蛋白和0.1 mg/L肌醇。

1.2.2分化培养基

采用M8培养基，其中添加30 g/L蔗糖、琼脂粉10 g/L，分别设置不同的激素配比（2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+2 mg/L ABA、1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT、2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT，2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+1 mg/L IAA、2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA、2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA）。

1.3水稻花药培养

选取花粉分化正处在单核靠边期的穗子，低温预处理 7 d，将取回的穗子经75%乙醇处理90 s，用10%双氧水溶液浸泡15 min，再用无菌水漂洗3次，然后将消毒过的穗子颖壳剪开，将花粉接种于诱导培养基上面。每瓶接种约50 枚，每个材料3 瓶，3次重复，放入暗培养室（26±2） ℃黑暗条件下培养，接种60 d后记录出愈的数目，计算愈伤组织诱导率，分化40 d后统计愈伤分化率。

1.4统计分析

愈伤组织诱导率=愈伤组织数/接种花药数×100%[7]；

愈伤分化率=愈伤组织分化数/愈伤组织数×100% 。

2结果与分析

2.1不同诱导培养基对籼稻复交F1花药出愈率的影响

2.2不同激素配比的M8培养基对籼稻复交F1花药出愈率的影响[HT]

由表2可见，以M8为诱导培养基（添加2，4-D 2 mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂10 g/L）设为对照，设置不同的激素配比，整体出愈率最高的培养基是添加了2 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L KT+2 mg/L ABA的培养基，出愈率在41.27%～55.57%，要远远高于对照组、只添加2 mg/L 6-BA、0.5 mg/L KT+2 mg/L 6-BA以及添加1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT的诱导培养基，方差分析差异极显著。这可能由于在诱导培养基中添加了2 mg/L ABA所致，对比2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT和1 mg/L6-BA+0.5 mg/L KT等2种激素配比，花粉出愈率也极显著高于对照，但是两者之间只有在02428配置的组合中差异极显著，而其余2个组合差异并不显著，这表明浓度稍高的6-BA对愈伤的产生具有一定促进作用。

2.3不同激素配比的M8培养基对籼稻复交F1花药分化率的影响[HT]

以M8为分化培养基（蔗糖30 g/L、琼脂10 g/L）设为对照，将产生的愈伤组织进行分化培养，由表3可知，添加 2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+1 mg/L IAA的M8分化培养基上愈伤组织分化率极显著高于对照组、激素配比为2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA组和2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA的分化培养基，分化率变异幅度为22.66%～44.97%，方差分析表明差异极显著。对比添加2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA和 2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA的2种激素配比，只有（镇42/中728）//02428组合的分化率差异极显著，其余组合两者之间差异并不明显。同时，02428配置的杂交组合在各个激素配比下相比其他组合，都获得了较高的分化率，这与前文中02428配置的杂交组合在M8诱导培养基上获得高出愈率的结果相一致，表明籼稻杂交F1中若含有广亲和血统，较易获得高的分化率，同时表明水稻花药培养效率受制于水稻品种的基因型。

3讨论与结论

成功的花药培养在一定程度上依赖于培养基的选择，不同的培养基对不同基因型的水稻材料有不同的培养效果，目前主要集中在M8、合5和N6等几种培养基上[8]。本研究采用M8和N6培养基对4个籼稻复交F1进行花药培养力研究，结果表明在2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+2 mg/L ABA 和2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+1 mg/L IAA的M8培养基上获得了较高的出愈率和分化率，因此更加适应于籼稻F1的花药培养，其中02428配置的杂交后代在出愈率和分化率上也显著高于其他杂交后代，这表明籼稻F1花药培养依赖于水稻品种基因型特征，而含有广亲和血统的籼稻杂交后代花药培养力较高，与前人的研究结果[2]也相一致。

在植物离体培养过程中，外源生长素被认为是植物胚胎发育所必需的[9]，外源激素的作用可以促进愈伤组织的发生和分化，在水稻花药培养中扮演着重要角色，但研究发现单一成分的激素培养的效果并不十分理想，而几种激素的搭配使用却可以在花粉脱分化阶段为组织的分化和成苗提供便利，由此可见水稻花药培养是一个复杂的生理生化过程，使用合理的激素组分及不同的激素配比是影响花培效率的重要因素[10-11]。本研究在设计了不同的激素配比后，在出愈率和分化率上面都获得了较好的效果，如在诱导培养基中添加 6-BA 可以促进愈伤组织的生成，在细胞脱分化过程中可以提高花粉胚状体的产生和增强形成根的趋势，对分化成苗起

主导作用，使得分化率和再生率得到显著提高。此外，在诱导培养基中添加2 mg/L ABA极大地提升了籼稻花药的出愈率，这可能由于诱导培养基中外源ABA可以诱导胚性愈伤产生，以及在继代培养中保持愈伤组织的胚性作用所致[12]。在分化培养基中添加IAA后，分化率也得到了提高，表明IAA对愈伤组织的分化有促进作用。

因试验设计所限，并没有进一步增加激素使用种类和使用浓度的范围，因此该结论仅在本研究范围内进行讨论，今后的试验可以扩大研究范围，以探讨能够显著提高籼稻杂交F1的花药培养力的技术方案。

参考文献：

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