干露时间对生物膜净化效果的影响

朱建新+程海华+曲克明+孙杰锋+郑文杰

摘 要：采用循环水养殖系统模拟装置，研究生物膜经不同干露时间处理后的净化作用效果及主要功能菌群落变化情况。实验结果表明：当干露时间为3 h时，系统经过21 h恢复运行后，生物膜对TAN和NO2--N的去除效果最好，分别为80.1%和93.5%；随着干露时间的延长，生物膜对CODMn的去除力逐渐变弱；随着干露时间的延长，生物膜上异养细菌、亚硝酸菌和硝酸菌数量明显减少，除了9 h组和15 h组外，其他各组间主要功能菌群数量差异显著（P<0.01）。在实际生产中，对生物滤池进行适当清洗有利于提高生物膜的净化效率，但清洗过程中生物膜的干露时间应控制在3 h之内。

关键词：循环水养殖系统 生物膜 干露时间

中图分类号：S959 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2017）03（a）-0118-04

在循环水养殖系统（RAS）中，生物滤池是使养殖废水被重新利用的核心处理单元[1]。生物膜是在生物载体表面形成的一种黏液状的膜，主要由微生物细胞和胞外聚合物两部分组成。在净水过程中，生物膜上的微生物群落在利用水体中营养物质完成自身代谢活动，生物膜具有过滤、吸附水中的有机颗粒物的作用，从而完成对水中有毒、有害物质的分解、转化、吸收和降解，实现养殖废水的循环利用[2]。目前，关于生物膜影响因素的研究非常多，如，光照[3]、基底类型[4]、营养水平[5]和水文条件[6]等，但生物膜依然是整个系统管理的重点和难点。

由于微生物的代谢速度很快，养殖过程中，生物膜处于不断的老化更新过程中，再加上生物滤料的吸附作用导致的生物膜过厚而滑落，生物滤料对水流的阻挡引起流速下降导致水中颗粒物的沉淀等因素的共同作用，生物滤池底部往往容易堆积较厚的生物污泥，这些生物污泥不但会堵塞底部排污孔，而且生物污泥的腐坏极易导致个别水质指标的严重超标，轻则影响养殖生物的正常生长，重则影响系统的正常运行，因此，生物滤池的清洗是养殖企业系统管理的重要组成部分。但是，由于缺乏对生物膜干露时间对生物膜净化效果和微生物菌群结构影响的了解，部分养殖在清洗生物滤池的过程中由于没有掌握好清洗时间，生物膜在空气中曝露时间过长，从而导致生物膜在清洗后净化效率显著下降，甚至出现严重“脱膜”、需要重新培养生物膜的情况。该实验通过研究不同干露时间下，生物膜主要菌群数量的变化情况及对养殖水体主要水质指标的去除情况，为养殖企业对生物滤池进行科学管理提供又一理论参考。

1 材料与方法

1.1 填料与试验装置

生物填料选用爆炸棉，其材质为PU海绵，基本参数为：比表面积350 m2/m3、密度0.024 g/cm3。

该试验共有5套循环水模拟装置，每套装置主要由生物滤器和蓄水箱两部分组成（图1）。生物滤器采用亚克力有机玻璃管，尺寸大小φ140 mm×600 mm，其进水端和出水端都有球阀可以控制水流速率，整个实验过程，每个滤器内水力停留时间（HRT）约为23～25 s；蓄水箱采用白色圆柱塑料水箱，其有效容积为200 L，水箱里有浸没式水泵、控温加热棒和曝气气石；生物滤器与蓄水箱之间采用φ25 mm的塑料软管连接。另外，通过调节曝气机气阀，使滤器中气水比（单位时间曝气量与进水量的体积比值）达到5∶1（赵倩，2013）。

1.2 生物膜培养

生物膜培养采用预培养法，实验前6周，往每个蓄水箱加入半滑舌鳎循环水养殖池水100 L，并添加50 mg/L微生态净水剂（厦门好润牌生力菌和亚硝菌克，富含硝化细菌、芽孢杆菌等益生菌，有益菌含量大于2×1010 CFU/g）作为挂膜菌种。另外，添加20 mg/L氯化銨、20 mg/L葡萄糖作为生物膜培养的补充氮源和碳源。每套系统水力停留时间为30 min，每星期换水1次，换水后重新添加同量的氯化铵和葡萄糖，并定期检测水中氨氮和亚硝态氮浓度，直至亚硝态氮浓度降低且达到稳定状态时，表明生物膜成熟。挂膜期间系统运行参数：pH：7.5～8.0，WT：26.5 ℃～28.0 ℃，DO≥6 mg/L，盐度（Sal）：27.5～28.0。

1.3 实验设计

1.3.1 实验分组

待各组生物滤器中生物膜成熟后，对试验装置进行分组。实验共分5组，随机选取其中一套试验装置作为对照组（不做任何处理），并命名为对照组；随机对剩余4套装置进行分组，依次命名为3 h组、6 h组、9 h组和15 h组。

1.3.2 实验操作步骤

（1）生物膜成熟后，分别排干5套系统的预培养用水；（2）立刻从养殖池中取0.5 m3养殖用水，（水质参数见表1），平均加入5套试验装置的蓄水箱中；（3）即刻运行对照组（即A组），且其他4组不运行，并确保其生物膜处于干露状态；（4）从对照组开始运行计时，3小时后运行3 h组，6小时后运行6 h组，9小时后运行9 h组，15小时后运行15 h组，依次保证对照组、3 h组、6 h组、9 h组和15 h组生物膜的干露时间分别为0、3、6、9、15 h。

1.3.3 细菌计数

（1）生物膜成熟后，对每套系统的生物膜进行取样，即用剪刀（事先经过消毒）分别从每套系统剪取3份大小相似的生物填料样品（尽量为长方体），分别放入盛有200 mL无菌陈海水的锥形瓶中，充分振荡混匀；（2）异养细菌的培养计数采用平板涂布法（2216E培养基）[7]，26 ℃下培养48 h后计数。亚硝化细菌和硝化细菌计数采用MPN3管法[8]，分别取1 mL稀释液加入到装有亚硝化细菌培养基和硝化细菌培养基的试管中，26 ℃培养4周，然后进行计数，最后推算出1 cm3生物填料上细菌的数量；（3）每套系统经过相应干露时间处理后，分别对各自生物膜上异养细菌、亚硝化细菌和硝化细菌进行培养计数，其操作方法同第一次计数方法。

1.3.4 日常水质指标监测

实验过程中，分别对各个组进行定时取水样，时间分别为各自运行初始、6 h、12 h和21 h时。测量其总氨氮（TAN）、亚硝酸盐氮（NO2--N）和高锰酸盐指数（CODMn），每个水样3个平行。

水质指标的检测依照《海洋监测规范》（GB 17378.4—2007）：TAN采用次溴酸盐氧化法；NO2--N采用萘乙二胺分光光度法；化学需氧量（CODMn）采用碱性高锰酸钾法测定； Sal、pH、DO、WT采用YSI-556多功能水质分析仪测定。

2 结果与分析

2.1 实验过程中各组的水质变化情况

2.1.1 TAN浓度

实验期间各组TAN含量变化情况见图2，经过6 h反应后，对照组TAN浓度比初始值略有升高，其他几组TAN浓度几乎不变；反应进行到12 h时，15 h组的TAN含量出现升高现象，其他几组均发生不同程度的下降，其中对照组下降最快；实验结束时，各组TAN含量比较：3 h组<对照组<6 h组<9 h组<15 h组。

2.1.2 NO2--N浓度

实验过程中，各组NO2--N浓度先升高，然后随着反应的进行又逐渐降低（见图3）。同一实验阶段下，各处理组NO2--N浓度与干露时间长短呈负相关；对照组在反应进行到12 h时，NO2--N浓度增加至最大；当反应继续进行到21 h时，各组NO2--N浓度都出现不同程度的降低，其中对照组下降幅度最大，且实验结束时，各组NO2--N浓度从小到大依次为：3 h组<6 h组<对照组<9 h组<15 h组。

2.1.3 高锰酸盐指数

当实验进行到6 h时，各组CODMn会发生波动，但波动幅度不剧烈；然后，随着反应的进行，各组CODMn逐渐趋于稳定。整个实验过程，相同阶段下，对照组CODMn均最低；当实验最后阶段，各组CODMn处于稳定状态时，其大小依次为：对照组<3 h组<6 h组<9 h组<15 h组（见图4），表明各组CODMn与干露时间呈负相关，干露时间越长，CODMn则越小。

2.1.4 各个指标的去除率

图5反应的是不同实验组生物滤器对TAN、NO2--N和CODMn的去除情况。3 h组对TAN去除率最高，其次为对照组，随着干露时间的延长，相应处理组对TAN的去除效果则越来越差；关于NO2--N 去除情况，3 h组和6 h组去除效果比对照组好，当干露时间达到15 h时，该组对NO2--N的去除率与9 h组相比，急剧下降，只有-5.5%，表明生物膜经过15 h干露处理后，其通过硝化反应对NO2--N的去除量小于亚硝化反应中NO2--N的生成量；觀察各实验组对CODMn的去除情况发现，随着干露时间的延长，生物膜对CODMn的去除能力逐渐变弱，3 h组与对照组差别较小，当干露时间为15 h时，该组对CODMn的去除率最小且为负值，为-9%，这可能说明干露时间达到15 h，生物膜可能会脱落一部分，不但使其生物分解氧化能力下降，同时脱落的生物膜部分会导致水体中的有机物含量升高。

2.2 细菌计数

2.2.1 异养细菌

干露处理前后，各实验组单位体积生物填料上异养细菌数量的对比情况如图6所示。干露处理前，对各实验组生物填料上异养细菌进行计数，发现各组异养细菌数量均达到108 CPU/cm3，且各组之间不存在显著性差异（P >0.05）；经过相应干露时间处理后，各组异养细菌数量发生剧烈变化，变化趋势为随着干露时间的延长，异养细菌数量减少程度越剧烈，其中对照组异养细菌数量几乎没有变化，另外，除了9 h组和15 h组，其他各组之间均存在极显著性差异（P <0.01）。

2.2.2 亚硝化细菌

观察图7发现，干露处理前，各实验组单位体积生物填料上亚硝化细菌的数量均介于（3.10～3.37）×106 CFU/cm3，各组之间不存在显著差异。经过相应干露处理后，除了对照组生物填料上亚硝化细菌数量略微增加外，其他各处理组均出现显著降低，降低趋势与干露处理时间呈负相关。

2.2.3 硝化细菌

图8表示的是干露处理前后，各实验组单位体积生物填料上硝化细菌数量的对比情况。干露处理前，各组生物填料上硝化细菌数量约有5×105 CFU/cm3，表明在相同生物填料上，硝化细菌数量远远小于异养细菌的数量，也小于亚硝化细菌的数量。干露处理后，各组硝化细菌数量都减少，且减少的幅度随着干露时间的变长而增大；另外，当干露时间控制在9 h内，各实验组硝化细菌数量存在极显著差异（P <0.01），当干露时间达到或超过9 h后，各组硝化细菌数量变化不再明显。

3 讨论

3.1 干露时间对生物滤池硝化作用的影响

硝化作用包括两个阶段：一是亚硝化菌属（Nitrosomonas）将氨氮转化为亚硝酸盐氮；二是硝化杆菌属（Nitrobacter）将生成的亚硝酸盐氮转化成硝酸盐氮[9]。该实验结果反应，当生物膜干露时间为3 h时，生物膜对TAN和NO2--N的去除效果比对照组更好，这些表明短时间的干露处理会增强生物膜的硝化作用强度。分析其原因可能是，生物滤池可以吸附截留一部分悬浮物（SS），这些SS不仅不会被硝化菌群分解利用，而且会使得滤料表面覆盖一层厚厚的“隔离层”，这些可能会造成生物膜局部表面形成无氧或低氧区，影响硝化反应的进行。有研究表明，当溶氧为0.5 mg/L时，亚硝酸菌增值速率降低40%，而硝酸菌则降低70%以上。短时间的干露处理，会导致生物膜表面的沉积物脱落，减少生物膜表面低氧或厌氧区域的形成，对硝化反应起到增强作用。随着干露时间的延长，生物膜脱落部分会增加，同时部分硝化菌群因缺乏营养而死亡，这些将导致硝化作用变弱，该实验中6 h、9 h和15 h组生物膜对TAN和NO2--N的去除效果越来越差。

3.2 干露时间与生物膜上主要功能菌数量变化关系的讨论

干露处理前，对成熟生物膜上的主要功能菌（如异养细菌、亚硝酸菌和硝酸菌）分别进行计数，结果表明异养细菌数量为1.60×108 CPU/cm3、亚硝酸菌数量为3.26×106CPU/cm3、硝酸菌数量为5.08×105 CPU/cm3。在生物膜上，自养菌生长速度较慢，往往无法与生长较快的异养细菌竞争空间和氧气。因此，生物膜上异养菌数量多于自养菌数量；亚硝酸菌比硝酸菌高出1个数量级，这与管敏和马悦欣的研究结果相一致。

各处理组经过相应时间的干露处理后，其生物膜上主要功能菌数量均发生不同程度的降低，其中异养细菌数量变化幅度最大。分析其原因可能是：异养细菌生长较快，世代周期较短，生物膜脱离水体后，大多数细菌会死亡；另外，干露过程中，生物膜上的黏附物脱落会导致部分细菌随着脱落，从而使生物膜上的异养细菌数量降低，且这种降低趋势会随着干露时间的延长而加剧。

实验过程中，3 h组亚硝酸菌和硝酸菌数量降低幅度明显小于同组异养细菌。这可能是因为生物滤池内部被填料填充满，虽然干露过程排掉了内部的水，但生物膜仍处于湿露状态；硝化细菌为自养型细菌，往往占据生物膜内层，仍然可以获得营养物质，同时受生物膜表面黏附物脱落的影响较小，再加上其世代周期一般大于8 h，因此短时间的干露处理不会导致硝化细菌数量急剧下降。

4 结语

在循环水养殖过程中，当生物污泥堵塞滤池底部用来排污的多孔管，需要排空滤池水体，对其底部进行清洗时，整个清洗过程尽量控制在3 h左右。因为生物膜短时间地曝露在空气中，虽然会对其分解利用有机物的能力产生抑制作用，但抑制效果不明显，然而会对其硝化作用产生一定的增强效果。如果干露时间过长，会对生物膜净化能力产生显著的抑制作用。该实验结果将为实际生产中科学管理生物滤池提供些许理论帮助。

参考文献

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[2] 張金莲，吴振斌.水环境中生物膜的研究进展[J].环境科学与技术，2007，30（11）：102-106.

[3] Rao TPG，Venugopalan VP，Nair KVK.Biofilm formation in a freshwater environment under photic and aphotic conditions[J].Biofouling，1997，11（4）：265-282.

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[7] Leonard N，Blancheton JP，Guiraud J.PPopulation of heterotrophic bacteria in an experimental recirculating aquaculture system[J].Aquacultural Engineering，2000（22）：109-120.

[8] 陈绍铭，郑福寿.水生微生物学实验法[M].北京：海洋出版社，1985.

[9] 程海华，朱建新，曲克明，等.有机碳源对循环水养殖系统生物滤池净化作用的研究进展[J].渔业现代化，2015（3）：28-32.