细菌感染影响牙周组织细胞表达环鸟苷-腺苷合成酶的实验研究

杨小军 谭咏梅 田智慧 周婷 赵望泓 侯晋

1.南方医科大学南方医院口腔科；2.南方医科大学口腔医学院，广州 510515

细菌感染影响牙周组织细胞表达环鸟苷-腺苷合成酶的实验研究

杨小军1,2谭咏梅1,2田智慧1,2周婷1,2赵望泓1,2侯晋1,2

1.南方医科大学南方医院口腔科；2.南方医科大学口腔医学院，广州 510515

目的 研究侵入牙周组织细胞内的细菌对细胞表达环鸟苷-腺苷合成酶（cGAS）的影响。方法将SYTO9标记的牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）以感染复数（MOI）为10与人牙周膜细胞（hPDLCs）共培养24 h后，使用激光共聚焦显微镜观察P. gingivalis对hPDLCs的侵袭情况，并应用荧光标记活细胞筛选（FACS）分选出被P. gingivalis入侵的hPDLCs，利用实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot对hPDLCs中cGAS的表达变化进行检测。此外还利用免疫组织化学技术对细菌感染性牙龈组织和正常牙龈组织中cGAS表达定位和表达水平变化进行分析。结果激光共聚焦显微镜下观察，P. gingivalis和hPDLCs共培养24 h后，几乎所有的细胞内都可观察到绿色荧光；被P. gingivalis感染的hPDLCs中cGAS表达水平明显上调；在牙龈组织中cGAS主要在上皮细胞和上皮下组织中的炎性细胞中表达；且细菌感染性的牙龈组织中cGAS的表达水平明显高于正常牙龈组织。结论侵入hPDLCs内的活体P. gingivalis，可以明显上调细胞中cGAS的表达；且在细菌感染的炎性牙龈组织中cGAS的表达也明显升高。该结果提示cGAS可能参与了牙周组织细胞中细菌来源的病原dsDNA的识别。

牙龈卟啉单胞菌； 人牙周膜细胞； 环鸟苷-腺苷合成酶； DNA感受器

固有免疫应答是机体防御感染性疾病的第一道防线。在固有免疫过程中，宿主免疫细胞借助模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs）迅速识别大量不同的病原体组分，通过激活下游信号转导通路，产生多种炎性细胞因子或Ⅰ型干扰素，发挥抗感染作用[1]。但是已有的大量研究[2]证明，过度的Ⅰ型干扰素反应与炎症性疾病和自身免疫性疾病的发生有着密切关系。现有的研究[3]结果已表明，细菌所产生的核酸类病原相关的分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）在宿主固有免疫信号的激活上发挥着重要作用。

在牙周病的发病机制中，微生物虽然是牙周病的始动因素，但是随着病情的发展，最终造成牙周组织损伤的原因却是由于过度的宿主免疫反应。因此固有免疫的信号传导调节是机体启动有效、适度的免疫应答的关键环节。目前有关牙周病免疫机制的研究多集中在细胞膜表面的Toll样受体，如TLR2、TLR4，以及胞浆内NOD样受体，如NOD1和NOD2，这些可以识别细菌表面复合物如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、肽聚糖和菌毛等PAMPs作用的受体上[4]，而细菌产生的核酸类PAMPs在牙周组织细胞中是被何种PRRs所识别的？关于这个问题，还未有明确答案。近年来的研究[5]发现干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）可被细菌、病毒等微生物产生的核酸分子，如DNA、RNA以及环二核苷酸（cyclic dinucleotides，CDNs）信号分子激活，促发Ⅰ型干扰素反应。由于STING分子中并不存在DNA和RNA结合结构域，STING本身不太可能直接与DNA和RNA相互作用，而需要借助细胞内其他PRRs[6]。目前并未发现一种在细胞内广泛存在的胞内DNA感受器（DNA sensor），因为不同的DNA Sensor所能识别的核酸分子不同，而且在不同的细胞中DNA Sensor的种类也不尽相同。

环鸟苷-腺苷合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS），又称为C6orf150或MB21D1，属于核酸转移酶家族成员，是近年来新发现的哺乳动物细胞内的DNA感受器[7]。cGAS可通过锌指结构直接结合到细胞内的dsDNA或入侵细胞的病毒DNA上，利用三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP），并由镁离子介导，催化产生2’3’-cyclic GMP-AMP（cGAMP），cGAMP在细胞内起到第二信使的作用，其具有独特的磷酸二酯键可结合并活化下游的信号分子STING，通过STING依赖性的方式诱导TBK1、转录因子IRF3和Ⅰ型干扰素的产生[8]。cGAS-cGAMP-STING信号通路是哺乳动物胞浆DNA识别的基本机制[8]。转染到细胞内的外源性DNA或DNA病毒感染后，在cGAS功能缺陷（cGAS-/-）鼠的细胞，包括成纤维细胞、巨噬细胞、树突状细胞（dendritic cell，DC）均不能产生干扰素（interferon，IFN）和其他抗病毒细胞因子[9]。研究[9]发现，cGAS诱导产生的IFN-β的数量级远多于其他DNA Sensor诱导产生的IFN-β，表明cGAS是细胞质的关键DNA Sensor。

cGAS作为宿主细胞胞浆内的关键DNA Sensor，对侵入牙周膜细胞的牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）所产生的核酸类PAMPS，是否同样存在着识别功能？对于这些问题的答案目前仍是未知。本研究旨在研究P. gingivalis侵入细胞后，对牙周组织细胞中cGAS表达的影响，为进一步探讨细菌所产生的核酸类信号分子在牙周病免疫中的作用及其信号途径奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验细菌

P. gingivalis ATCC33277菌株（Microbiologics公司，美国）。

1.2 主要试剂和仪器

胰化酪蛋白大豆培养基（trypticase soy broth，TSB）、氯化血红素、维生素K3（Sigma公司，美国），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、DMEM培养基（Corning公司，美国），RNAiso Plus、逆转录试剂盒（TaKaRa公司，日本），荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（Roche公司，瑞士），SYTO9（Invitrogen公司，美国），Alexa Fluor®594 Phalloidin（Molecular Probes公司，美国），Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail、RIPA Lysis and Extraction Buffer、Ultravision anti-rabbit免疫组化试剂盒（Thermo Fisher公司，美国），兔抗人C6orf150多克隆抗体（Abcam公司，英国），IRDye®680RD羊抗兔荧光二抗（Licor公司，德国）。

Anoxomat MarkⅡ厌氧微需氧培养系统（MART公司，荷兰），电子天平（Sartorius公司，德国），倒置相差显微镜及照相系统（Olympus公司，日本），流式细胞仪（BD FACSCalibur公司，美国），罗氏L480实时荧光定量PCR仪（Roche公司，瑞士），Odyssey近红外成像系统（Licor公司，德国）。

1.3P. gingivalis的培养

将P. gingivalisATCC33277复苏后接种于TSB羊血琼脂培养基（含5%脱纤维羊血、5 mg·L-1氯化血红素和1 mg·L-1维生素K3），37 ℃厌氧培养（80%N2、10%CO2、10%H2）。

1.4 人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）的体外培养

经南方医科大学南方医院伦理委员会批准，患者及监护人的知情同意后，样本取自南方医科大学南方医院口腔科12～25岁牙周组织健康，因正畸治疗需要，减数拔除的前磨牙，牙齿拔出后立即放置于100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素的DMEM培养基中，冰上放置转移至实验室，无菌PBS缓冲液冲洗3遍，无菌湿润条件下刮取根中1/3的牙周膜组织，利用组织块酶消化法[10]原代培养人hPDLCs细胞。一般原代培养1周左右，可见细胞从组织块周围游出。待细胞生长汇合达70%～80%时，进行传代、鉴定之后用于后续的实验研究。

1.5 体外感染实验

使用SYTO9按照产品说明标记P. gingivalis，以感染复数（multiplicity of infection，MOI）为10加入到hPDLCs中共培养24 h后，细胞用PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤，0.1%Triton透化处理10 min，PBS洗涤后，加入1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）孵育20～30 min，滴加适宜浓度的Alexa Fluor®594 Phalloidin对细胞骨架中的丝状肌动蛋白（filamentous actin，F-actin）进行染色，使用二氨基苯基吲哚（diamidino-phenyl-indole，DAPI）对细胞核进行复染，激光共聚焦显微镜下观察。

取第4～10代hPDLCs，将用SYTO9标记的P. gingivalis，以MOI为10加入hPDLCs中共培养24 h，使用荧光标记活细胞筛选（fluorescence-activated cell sorting，FACS）分选出被感染的hPDLCs，常规培养。分别提取分选出的P. gingivalis感染细胞和作为对照组的未经任何处理的正常hPDLCs细胞的总RNA和蛋白，用于后续的实时定量逆转录聚合酶链反应（quantitative real time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）和免疫印迹（Western blot）实验。

1.6 qRT-PCR

将收集的细胞用RNAiso Plus裂解，按照产品说明提取总RNA。以总RNA为模板，使用PrimerScript RT reagent Kit试剂盒进行逆转录。qRT-PCR检测cGAS基因在对照组与P. gingivalis感染组hPDLCs中的表达。引物序列如下。cGAS上游引物序列：5’-ACATGGCGGCTATCCTTCTCT-3’，下游引物序列：5’-GGGTTCTGGGTACATACGTGAAA -3’，230 bp；磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物序列：5’-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’，下游引物序列：5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’，259 bp。反应条件为：95 ℃ 5 min（预变性）；95 ℃ 10 s（变性）；60 ℃20 s（退火）；72 ℃ 20 s（延伸）；变性、退火、延伸共45个循环。

1.7 Western blot

将收集的细胞用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解，提取总蛋白，用BCA法定量，每个样本以40 μg的总蛋白量进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉-TBST封闭之后，1︰1 000稀释的兔抗人C6orf150（cGAS/MB21D1）多克隆抗体4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次，每次5 min。1︰15 000稀释IRDye®680RD羊抗兔荧光二抗室温避光孵育1 h，TBST洗涤3次，每次5 min。Odyssey近红外成像系统扫描成像。

1.8 免疫组织化学

经南方医科大学南方医院伦理委员会批准，患者知情同意的情况下将临床上因牙周治疗需要切除的感染性牙龈组织以及因第三磨牙拔除需要切除的正常牙龈组织各3例，用4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，5 μm连续切片。所得的切片二甲苯脱蜡梯度水化至水，PBS洗涤；枸橼酸钠缓冲液热修复抗原，PBS洗涤；血清封闭，室温20 min，去除多余血清，勿洗；滴加1︰50稀释的兔抗人C6orf150（cGAS/MB21D1）多克隆抗体4 ℃过夜，PBS洗涤。滴加羊抗兔二抗37 ℃孵育15 min，PBS洗涤。加入辣根过氧化物酶标记链霉卵白素37 ℃孵育15 min，PBS洗涤；DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片，显微镜观察并照相。以PBS代替一抗或二抗做阴性对照。

1.9 统计学分析

qRT-PCR实验数据采用2-ΔΔCT法进行处理。用SPSS 19.0统计软件进行相关数据分析，两组间数据比较采用独立样本t检验，检验水准α=0.05，采用双侧性检验。

2 结果

2.1P. gingivalis感染hPDLCs

以MOI为10的P. gingivalis感染hPDLCs 24 h后，激光扫描共聚焦显微镜下观察可见：被SYTO9标记的、呈现绿色荧光的P. gingivalis主要位于hPDLCs的胞浆内，且主要分布在核周，而且几乎所有的细胞内都可观察到绿色荧光（图1）。

2.2P. gingivalis对hPDLCs表达cGAS的影响

以MOI为10的P. gingivalis感染hPDLCs 24 h后，qRT-PCR的结果显示：被P. gingivalis感染的hPDLCs中cGAS的表达水平明显高于对照组（P＜0.001）（图2上）。应用Western blot对该结果进行了蛋白水平的验证。Western blot的结果同样显示，被P. gingivalis感染的hPDLCs中cGAS的表达水平高于对照组（图2下）。

图1 P. gingivalis侵入hPDLCs细胞24 h 激光扫描共聚焦显微镜 × 600Fig1 P. gingivalis invade hPDLCs after co-culture for 24 h laser scanning confocal microscope × 600

图2 侵入hPDLCs的P. gingivalis上调细胞中cGAS的表达Fig2 Cytosolic P. gingivalis upregulates cGAS in hPDLCs

2.3 感染性牙龈组织中cGAS表达的变化

在牙龈组织中，cGAS主要在上皮细胞中表达，而且cGAS的表达水平在感染性牙龈组织（图3A）中明显高于正常牙龈组织（图3C）；此外，在感染性的牙龈组织中，由于上皮下有大量的炎性细胞浸润，因此还可以观察到cGAS在上皮下炎症细胞中同样有表达（图3B），而正常牙龈组织的上皮下只有少量炎性细胞，因此其上皮下cGAS的表达水平同样低于炎性牙龈组织（图3D）。

图3 cGAS在炎性牙龈组织和正常牙龈组织中的表达 免疫组织化学Fig3 The expression of cGAS in inflammatory gingival tissues and normal gingival tissues immunohistochemistry

3 讨论

在牙周病的发病机制中，最终造成牙周组织损伤的原因是过度的宿主免疫反应。龈下菌斑中的微生物所产生的各个组分对宿主免疫的调节与牙周疾病的发生和发展有着密切的关系，目前有关牙周病免疫机制的研究多集中在细胞膜表面的Toll样受体及胞浆内的NOD样受体，这些可以与细菌表面PAMPs作用的受体所引发的核因子活化B细胞κ轻链增强子、丝裂原活化蛋白激酶等信号通路的激活上[4]，而关于细菌所产生的核酸分子在牙周病免疫反应中的作用迄今为止尚未明晰。

cGAS作为一种新型的胞质DNA感受器，能时刻监视细胞质中不正常的DNA入侵或者积累[11]。胞外的核酸类PAMPs无法直接进入细胞内激活机体的免疫反应，但入侵到细胞内的病毒和细菌都可将核酸类PAMPs携带至胞内，病毒和细菌来源的病原dsDNA都能激活cGAS从而诱导IFN以及其他炎症因子的产生[11]。P. gingivalis不但可分泌大量的毒力因子对牙周组织产生破坏作用，而且还可侵入到上皮细胞、成纤维细胞及成骨细胞等宿主细胞内[12]。本研究中用P. gingivalis感染hPDLCs，用荧光标记和激光扫描共聚焦成像，检测到P. gingivalis入侵到了hPDLCs内。

FACS是一种很好的纯化表型已知细胞群的方法。虽然前期实验已经证明P. gingivalis与hPDLCs共培养24 h后，其侵袭效率超过90%[13]，但在本研究中仍使用FACS将被P. gingivalis入侵的细胞筛选出来，使得研究对象纯度更高，具有单一性。

本研究结果显示被P. gingivalis侵入的hPDLCs中cGAS的表达在mRNA和蛋白水平上明显上调，而且在细菌感染性牙龈组织中cGAS的表达也明显高于正常牙龈组织。微生物入侵牙周组织细胞，可同时将DNA、RNA以及CDNs信号分子也携带进入细胞，cGAS作为胞浆内的DAN感受器，能够监视病原微生物携带进入宿主细胞内的核酸类PAMPs，从而激活Ⅰ型干扰素反应[11]。研究[2]证明，过度的Ⅰ型干扰素反应与炎症性疾病和自身免疫性疾病的发生有着密切关系。细菌感染后，牙周组织细胞中cGAS的表达升高，是否意味着Ⅰ型干扰素反应的激活？以及牙周致病微生物所携带的核酸类PAMPs是否也参与了牙周组织损伤？有关问题仍有待于进一步的研究。

本研究结果提示，在牙周炎的发病过程中，一些可以入侵到宿主细胞内的细菌，如P. gingivalis等，可将核酸类的PAMPs带入宿主细胞内，而cGAS可能参与了这些细菌来源的病原dsDNA的识别。

[1] Takeuchi O, Akira S. Pattern recognition receptors and inflammation[J]. Cell, 2010, 140(6):805-820.

[2] Holm CK, Paludan SR, Fitzgerald KA. DNA recognition in immunity and disease[J]. Curr Opin Immunol, 2013, 25 (1):13-18.

[3] Oliveira SC. Innate immune sensing of nucleic acids from pathogens[J]. Microbes Infect, 2014, 16(12):977-978.

[4] Farges JC, Keller JF, Carrouel F, et al. Odontoblasts in the dental pulp immune response[J]. J Exp Zool B Mol Dev Evol, 2009, 312B(5):425-436.

[5] Burdette DL, Vance RE. STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol[J]. Nat Immunol, 2013, 14(1):19-26.

[6] Barber GN. STING-dependent cytosolic DNA sensing pathways[J]. Trends Immunol, 2014, 35(2):88-93.

[7] Civril F, Deimling T, de Oliveira Mann CC, et al. Structural mechanism of cytosolic DNA sensing by cGAS[J]. Nature, 2013, 498(7454):332-337.

[8] Ablasser A, Goldeck M, Cavlar T, et al. cGAS produces a 2’-5’-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING[J]. Nature, 2013, 498(7454):380-384.

[9] Li XD, Wu J, Gao D, et al. Pivotal roles of cGAS-cGAMP signaling in antiviral defense and immune adjuvant effects [J]. Science, 2013, 341(6152):1390-1394.

[10] 麻丹丹, 高杰, 吴补领. 改良组织块酶消化法培养人龋损牙髓干细胞的实验研究[J]. 牙体牙髓牙周病学杂志, 2011, 21(7):371-374. Ma DD, Gao J, Wu BL. Culture of human caries dental pulp stem cells with combined explants method and enzymatic separation method[J]. Chin J Conserv Dent, 2011, 21(7): 371-374.

[11] Atianand MK, Fitzgerald KA. Molecular basis of DNA recognition in the immune system[J]. J Immunol, 2013, 190(5): 1911-1918.

[12] Baek KJ, Ji S, Kim YC, et al. Association of the invasion ability ofPorphyromonas gingivaliswith the severity of periodontitis[J]. Virulence, 2015, 6(3):274-281.

[13] 谭咏梅, 侯晋, 杨小军, 等. 侵入细胞内的牙龈卟啉单胞菌影响人牙周膜细胞的增殖及成骨分化[J]. 南方医科大学学报, 2016, 36(4):525-531.

Tan YM, Hou J, Yang XJ, et al. Effects of intracellularPorphyromonas gingivalison proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal ligament cellsin vitro[J]. J South Med Univ, 2016, 36(4):525-531.

（本文编辑 杜冰）

Effects of cytosolic bacteria on cyclic GMP-AMP synthase expression in human gingival tissues and periodontal liga- ment cells

Yang Xiaojun1,2, Tan Yongmei1,2, Tian Zhihui1,2, Zhou Ting1,2, Zhao Wanghong1,2, Hou Jin1,2. (1. Dept. of Stomatology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China; 2. College of Stomatology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China)

Objective This work aims to determine the effect of cytosolic bacteria on the expression of cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) in human periodontal ligament cells (hPDLCs) and gingival tissues.MethodsThe ability ofPorphyromonas gingivalis(P. gingivalis) to invade hPDLCs was detected using laser scanning confocal microscope assay at a multiplicity of infection of 10.P. gingivalis-infected cells were sorted by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Then, quantitative real time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot were used to detect cGAS expression in infected cells. Finally, the location and expression of cGAS in inflammatory and normal gingival tissues were investigated by immunohistochemistry.ResultsP. gingivalisactively invaded hPDLCs. Moreover, cGAS expression significantly increased inP. gingivalis-infected cells. Although cGAS was expressed in the epithelial and subepithelial cells of both inflamed and normal gingival tissues, cGAS expression significantly increased in inflamed gingival tissues.ConclusionCytosolic bacteria can upregulate cGAS expression in infected cells. These data suggest that cGAS may act as pattern-recognition receptors and participate in recognizing cytosolic nucleic acid pathogen-associated molecular patterns.

Porphyromonas gingivalis; human periodontal ligament cells; cyclic GMP-AMP synthase; DNA sensor

Q 26

A

10.7518/hxkq.2017.02.018

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81500870); President Foundation of Nanfang Hospital, Southern Medical University (2013C017). Correspondence: Hou Jin, E-mail: houjin@smu.edu.cn.

2016-09-30；

2016-12-27

国家自然科学基金（81500870）；南方医科大学南方医院院长基金（2013C017）

杨小军，讲师，博士，E-mail：yxj_den@163.com

侯晋，副教授，博士，E-mail：houjin@smu.edu.cn