口腔干预措施对牙周炎大鼠颈动脉牙龈卟啉单胞菌检出量及C-反应蛋白表达的影响

任秀云 王冲 刘欣 李豪 马千惠 林牧 石学雪 高晋华

山西医科大学口腔医院牙周科，太原 030001

·牙周病学专栏·

口腔干预措施对牙周炎大鼠颈动脉牙龈卟啉单胞菌检出量及C-反应蛋白表达的影响

任秀云 王冲 刘欣 李豪 马千惠 林牧 石学雪 高晋华

山西医科大学口腔医院牙周科，太原 030001

目的 建立慢性牙周炎（CP）合并高脂血症（HL）的SD大鼠模型并对其进行口腔干预，检测大鼠颈动脉局部C-反应蛋白（CRP）的表达情况及牙龈卟啉单胞菌的检出量，探讨牙周炎与动脉粥样硬化的相关性。方法SD大鼠随机分为3组，A组为对照组，B组为HL组，C组为CP+HL组。C组分为C1组（不治疗组），C2组（基础治疗组），C3组（拔牙组）；C2组又分为C2-1组（单纯牙周基础治疗组），C2-2组（牙周基础治疗+米诺环素+抗生素组）；C3组又分为C3-1组（拔除患牙组），C3-2组（拔除患牙+抗生素组）。建模开始15周后随机处死B组大鼠1只，取颈动脉分叉血管组织进行油红O染色，观察到泡沫细胞形成则HL建模成功。建模成功后进行2次口腔干预，干预结束后5周处死所有大鼠，取双侧颈动脉血管分叉处组织，分别采用免疫组织化学法检测CRP相对含量，16sRNA半定量法检测样本中的牙龈卟啉单胞菌的相对含量。结果免疫组织化学结果显示，B、C组CRP阳性表达明显高于A组（P＜0.05），与C1组相比，C组各干预组的CRP表达均降低（P＜0.05），其中辅助抗生素组较不加抗生素组阳性表达更低（P＜0.05），C2-2组在各干预组中阳性表达最低。牙龈卟啉单胞菌检测结果显示，C1组检出量最高，明显高于A、B组（P＜0.05）；C组各干预组的检出量均较C1组低（P＜0.05），C3-2组最低（P＜0.05）。结论伴HL的牙周炎大鼠不加干预任其发展，颈动脉血管中CRP的表达及牙龈卟啉单胞菌检出量都明显增加，血管病变逐渐加重。牙周基础治疗和拔牙均可有效降低颈动脉血管中CRP的表达及致病菌含量，其中牙周基础治疗对CRP表达的降低作用更明显，拔牙对降低牙周致病菌的作用更有效；基础治疗或拔牙时若辅以局部及全身抗炎药物，均可以有效提高CRP和牙周致病菌的降低作用。

高脂血症； 牙周炎； 牙龈卟啉单胞菌； C-反应蛋白； 牙周基础治疗

近年来，慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）与心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）之间的关系越来越受重视。研究[1]证实，牙周状态不良可能是导致CVD发生的危险因素之一，牙周病患者CVD患病率较健康人高25%～50%。CVD的主要病理基础是动脉粥样硬化，慢性感染及其相关的炎症过程可直接影响动脉粥样硬化的病理生理学过程，而慢性牙周炎同样也是一种由牙周致病菌所引起的慢性感染。牙周袋内的菌斑微生物及其毒性代谢产物可随咀嚼活动通过破损的牙周袋壁软组织进入血液循环播散至全身，引起反复的无症状菌血症，同时可定植于血管内皮细胞，对心血管系统产生不良影响。本研究通过检测CP合并高脂血症（hyperlipidemia，HL）大鼠模型的颈动脉血管组织中牙龈卟啉单胞菌的相对含量，同时对血管局部组织C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）的表达情况进行免疫组织化学检测，以探讨口腔各种干预措施对合并高脂血症的牙周炎大鼠模型的影响，为临床合并高脂血症的牙周炎患者的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康清洁级SD大鼠50 只，雄性，6周龄，体重200～250 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号SCXK（京）2009—0004。

1.1.2 主要试剂与实验仪器 OlympusDP72型显微照相系统（Olympus公司，日本）。胆固醇（分析纯）、猪胆盐饲料（北京奥博星生物技术有限公司提供）。维生素D3注射液（上海通用药业股份有限公司，批号为111111）。阿莫西林胶囊（哈药集团制药总厂，批号为A111200318）。甲硝唑片（亚宝药业集团股份有限公司，批号为120105）。盐酸米诺环素软膏（日本SunStar INC公司，批号为1111181）。

1.2 细菌培养及鉴定

本实验使用的牙周致病菌为牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277标准菌株[2]，由首都医科大学口腔微生物研究室提供。

1.3 动物分组

将50只SD大鼠分为3组，A组为正常对照组（7只），B组为HL组（8只），C组为CP+HL组（35只）。C组又分为3个组，C1为自然进程组（7只），C2为基础治疗组，C3为拔牙组；C2组再分为单纯牙周基础治疗组（C2-1组，7只）和牙周基础治疗+米诺环素+抗生素组（C2-2组，7只），C3组再分为拔牙组（C3-1组，7只）和拔牙+抗生素组（C3-2组，7只）。

1.4 动物建模

1）A组不进行任何干预。2）B组HL模型建立方法[2]如下。一次性腹腔注射维生素D3（每100 g体重注射剂量为0.23 mL），2周内逐渐增加高脂饲料（高脂饲料配方：质量分数1.5%胆固醇+0.2%猪胆盐+5%猪油+93.3%基础饲料）直至完全替代普通饲料。15周后随机处死B组大鼠1只，取其颈动脉分叉处约1 cm血管组织，剥离动脉筋膜，冰冻切片，油红O染色，观察红染泡沫细胞。3）C组为CP+HL组，HL模型建立同上，CP模型建立方法（与HL模型在时间上同步）如下。腹腔注射5%水合氯醛溶液（每100 g体重注射剂量为0.7 mL）麻醉。以大鼠双侧上颌第一、二磨牙作为实验牙。先用3—0丝线缠绕于0.20 mm的正畸结扎丝上，再将结扎丝以8 字结扎的形式结扎于双侧上颌第一、二磨牙（M1、M2）的牙颈部，定期涂布牙龈卟啉单胞菌悬液并检查结扎情况[3]。术后15 周（从开始建模起），随机检查C组口腔情况，发现大鼠有牙龈红肿、探诊出血、深牙周袋、实验牙松动等临床牙周炎表现即为CP建模成功；同时安乐死法随机处死1只B组大鼠，油红O染色，若发现有脂质沉积形成，说明HL建模成功，即开始进行口腔干预。

1.5 口腔干预方法

拆除结扎丝后，各组给予不同的口腔干预措施。C1组：任其自然发展，不加任何口腔干预治疗措施。C2组：C2-1组分别于建模成功后第2、4周进行牙周基础治疗（包括牙周刮治和根面平整术），每次选择同侧2颗实验牙；C2-2组，在基础治疗的基础上局部用米诺环素，每次干预后同时用抗生素（200 mg·kg-1阿莫西林+100 mg·kg-1甲硝唑）灌胃，每日1次，疗程3 d。C3-1组基础治疗同步进行2次拔牙，每次拔除同侧2颗实验牙；C3-2组在此基础上每次拔牙后加用抗生素（200 mg·kg-1阿莫西林+100 mg·kg-1甲硝唑）灌胃，每日1次，疗程3 d。

1.6 标本采集及处理

实验组大鼠进行2次牙周干预，干预结束后5周处死所有大鼠，取双侧颈动脉血管分叉处约1 cm组织进行检测。左侧血管组织经固定包埋后以1.5 μm厚度横断切片，进行CRP免疫组织化学染色，观察染色强度，并使用医学图像分析系统（BI-2000），对所有切片进行半定量分析，以颈动脉分叉处内侧为测量部位，细胞质出现棕黄色染色为CRP阳性，按照分层抽样法在每个部位随机选择5个阳性区域，测定该部位的灰度值，染色程度越深，灰度值越小。右侧血管新鲜组织置于-70 °C保存，放入无菌Eppendorf管中，应用德国Analytik Jena AG公司提供的细菌DNA提取试剂盒，采用16sRNA法测定各组大鼠颈总动脉血管组织中的牙龈卟啉单胞菌DNA相对含量，具体方法见本课题组前期研究[2]。

1.7 统计学分析

用SPSS 13.0统计学软件处理各组数据，组间比较采用完全随机设计资料的方差分析，各组间两两比较采用LSD-t检验，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 颈动脉血管组织的CRP表达

颈动脉血管组织CRP表达的定位结果见图1。

图1 颈动脉血管壁CRP的表达 免疫组织化学染色 × 400Fig1 CRP expression in carotid artery immunohistochemical staining × 400

A组（正常对照组），血管壁形态正常，无明显增厚，弹性纤维排列整齐，未见CRP阳性表达（图1A）。B组（HL组），血管壁明显增厚，内膜下可观察到脂质沉积，内中膜可见大量泡沫细胞（图1B中箭头示），CRP阳性表达，泡沫细胞的细胞质呈黄褐色着色，平滑肌细胞变性、萎缩，弹性纤维排列紊乱。C1组（CP+HL自然进程组）内膜下观察到多个明显的动脉粥样硬化斑块病灶、脂质核并有钙盐沉积（图1C中黄色箭头），泡沫细胞（图1C中红色箭头）散在，平滑肌细胞萎缩变性，细胞数目减少，并向内膜迁移，导致内膜增厚，CRP呈强阳性表达且着色呈深褐色，弹性纤维萎缩甚至断裂。C2-1组（CP+HL基础治疗组），可见血管壁增厚，内膜下散在脂质沉积，泡沫细胞较多，CRP阳性表达，呈黄褐色着色，平滑肌细胞部分变性，弹性纤维排列较为整齐（图1D）。C2-2组（CP+HL基础治疗+米诺环素+抗生素组），可见稍增厚的内中膜，有阳性表达区，呈棕黄色至黄褐色，泡沫细胞较少，平滑肌细胞少量变性，弹性纤维排列较为整齐（图1E）。C3-1组（CP+HL拔牙组），血管壁厚薄不均，平滑肌细胞层观察到多个脂质核，可见钙化坏死组织、纤维帽，细胞数目显著减少，CRP强阳性表达，泡沫细胞较少（图1F）。C3-2组（CP+HL拔牙+抗生素组），可见血管壁增厚，大量泡沫细胞，CRP阳性表达呈黄褐色，平滑肌细胞变性萎缩，弹性纤维排列紊乱（图1G）。

将CRP免疫组织化学染色结果进行半定量分析，结果见表1。阳性染色强度与灰度值呈反比，即阳性染色越强，则灰度值越小，分析结果可见：不同组的差异有统计学意义（F=102.190，P=0.000），其中B、C组灰度值均小于A组（P＜0.05），C1组灰度值最低；与C1组相比，C组各干预组（C2-1、C2-2、C3-1、C3-2）中除C3-1组外，其灰度值差异均有统计学意义（P＜0.05），其中C2-2组灰度值最高；C3-2组灰度值大于C3-1组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 颈动脉血管组织牙龈卟啉单胞菌DNA相对含量

颈动脉血管组织牙龈卟啉单胞菌DNA的相对含量见图2和表2。

表1 CRP在各组颈动脉血管壁阳性表达的灰度值Tab1 Gray values of CRP positive expression in carotid artery in different groups n=7, x±s

图2 颈动脉部分样本的聚合酶链反应扩增产物电泳结果Fig2 Electrophoresis results of polymerase chain reaction amplification product of carotid artery samples

表2 牙龈卟啉单胞菌在各组颈动脉血管壁的相对含量Tab2 The relative expression of Porphyromonas gingivalis in carotid artery in different groups n=7, x±s

由图2可见，所有大鼠的颈总动脉分叉区组织标本均扩增出预期条带，牙龈卟啉单胞菌检出率为100%。每份标本使用通用引物和细菌特异性引物进行聚合酶链式反应扩增后，扩增产物的电泳结果表现不完全相同。经16sRNA半定量检测，牙龈卟啉单胞菌在各组中的相对含量见表2。由表2可见，C1组最高，达到1.22±0.07，明显高于A、B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与C1组相比，C组各干预组（C2-1、C2-2、C3-1、C3-2）的相对含量均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；在基础治疗组，C2-2组牙龈卟啉单胞菌的相对含量较C2-1组更低（P＜0.05）；所有干预组（C2-1、C2-2、C3-1、C3-2）中，C3-2组牙龈卟啉单胞菌的相对含量最低（P＜0.05），提示拔牙+抗生素的应用在降低牙龈卟啉单胞菌含量方面更有效。

3 讨论

目前已有大量流行病学及实验数据支持牙周炎可促进动脉粥样硬化疾病进程这一观点，CRP作为联系这两大炎症性疾病的重要炎症标志物，其作用已经得到了充分的验证[4-5]。

本课题组在前期研究[2-3]中发现，牙周干预治疗不同时期血清CRP的含量呈现动态变化，牙周基础治疗、单纯药物治疗以及拔除患牙等口腔干预措施在短期内都可能增加动脉粥样硬化的风险，而长期效果则显示可能会降低该风险。本实验在前期研究基础上，取大鼠处死后双侧颈动脉血管组织，一侧血管组织采用免疫组织化学法检测CRP的相对含量，另一侧组织采用16sRNA的方法检测牙龈卟啉单胞菌的相对含量，结果发现：自然进程组血管病变最严重，出现动脉粥样硬化斑块、纤维帽及钙盐沉积，血管CRP阳性表达及细菌相对含量最高，提示伴有HL的牙周炎大鼠如果不予治疗任其病变发展，可能会加重其血管病变，并且CRP和牙龈卟啉单胞菌可能均参与了该病变的过程。

DeStefano等[6]的研究发现，牙周治疗能够降低包括血清CRP在内的一些炎症因子的浓度。本实验进行口腔干预后，各干预组与自然进程组相比，血管壁CRP阳性表达弱，血管病变程度减轻，这与De-Stefano等[6]的研究结果一致。本实验中基础治疗辅助局部米诺环素和服用甲硝唑组的血管最接近正常对照组，各干预组的颈动脉血管局部CRP表达及牙龈卟啉单胞菌检出量均降低，其中基础治疗辅助局部米诺环素和服用甲硝唑组CRP的阳性表达最低。这提示在牙周基础治疗的基础上加用局部及全身药物可能会有助于颈动脉血管的改善。这与本课题组前期血清CRP变化的研究结果一致[2]，均提示对合并HL的牙周炎患者进行治疗时，辅以局部及全身药物治疗，可能会降低有创治疗引起的全身炎症反应加剧而可能造成CVD发生的风险。拔牙组结果显示，单纯拔牙对颈动脉血管造成的风险可能不亚于自然进程组，拔牙后辅以甲硝唑则可显著降低该风险。这提示临床对于合并HL的牙周炎患者，即使是拔除不能保留的牙周炎患牙，也应该辅以全身药物以降低风险。

各型牙周致病菌中，牙龈卟啉单胞菌是证据充分的牙周致病菌，各类研究报告的检出率各有不同，84%～100%不等[7-8]。本实验结果显示：与自然进程组和牙周基础治疗组相比，拔牙组的颈动脉血管组织牙龈卟啉单胞菌的相对含量显著下降（P＜0.05），拔牙时辅以抗生素组的细菌相对含量最低（P＜0.01），这提示在降低血管内牙龈卟啉单胞菌含量方面，拔牙措施较常规牙周基础治疗措施更彻底。由此推测，临床上及时拔除无法保留的松动患牙，可能更有利于降低牙周组织及颈动脉血管中牙周病原菌的数量。Takamatsu等[9]曾采用DNA探针法检测牙周基础治疗对牙周致病菌检出率的影响，发现牙周基础治疗可使牙龈卟啉单胞菌减少，与本研究结果一致。值得注意的是，本实验在所有的颈动脉标本中均检测到牙龈卟啉单胞菌，检出率为100%。Ford等[10]采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测动脉粥样硬化斑块，牙龈卟啉单胞菌的检出率为100%；另外的研究[11-12]则较低，分别为26%和21.6%。本研究中，对照组也检测出牙龈卟啉单胞菌，提示该细菌可能是口腔常驻菌。统计学分析显示，虽然对照组与HL组均有牙龈卟啉单胞菌的检出，但组间差异有统计学意义，二者与HL+CP组间的差异也均有统计学意义（P＜0.01）。由此推测：牙龈卟啉单胞菌作为口腔常驻菌，在健康牙周组织内即存在，且易通过咀嚼等口腔运动随血液循环播散定植于血管分叉处，但此时菌量很少，并不会导致血管的炎症改变。本课题组将进一步对牙周组织内牙龈卟啉单胞菌进行检测，以验证此结论。

综上所述，伴有HL的牙周炎大鼠如果不干预任其病变发展，颈动脉血管的动脉粥样硬化病变会明显加重，并且CRP和牙龈卟啉单胞菌可能均参与了病变过程。进行各种口腔干预措施时，拔牙在降低血管内口腔致病菌含量方面有优势，但是牙周基础治疗对改善血管局部炎症反应较拔牙更有效；但二者均属于侵入性治疗方法，其造成的炎症反应有加剧动脉粥样硬化病变的风险，辅助局部和全身抗生素应用则可以有效降低风险。临床上对于此类患者的治疗应综合考虑各方面因素，选出最佳方案。

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（本文编辑 吴爱华）

Effects of oral interventions on carotid artery in rats with chronic periodontitis for the detection of Porphyromonas gingivalis and the expression of C-reactive protein

Ren Xiuyun, Wang Chong, Liu Xin, Li Hao, Ma Qianhui, Lin Mu, Shi Xuexue, Gao Jinhua. (Dept. of Periodontology, School of Stomatology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

Objective This study aimed to establish a SD rat model of chronic periodontitis (CP) merged with hyperlipidemia (HL), perform periodontal treatment, detect the expression of partial C-reactive protein (CRP) and Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) in the rat carotid artery, and explore the relationship between periodontitis and atherosclerosis.MethodsSD rats were randomly divided into three groups: control group (A), HL group (B), and CP+HL group (C). Group C rats were divided into natural process group (C1), scaling and root planning group (C2), and tooth extraction group (C3). Group C2 rats were randomly divided into C2-1 (scaling and root planning group) and C2-2 (scaling and root planning+minocyline+systemic antibiotics group). Group C3 rats were randomly divided into C3-1 (tooth extraction group) and C3-2 (tooth extraction+systemic antibiotic group). One rat from group B was randomly selected and sacrificed after 15 weeks. Subsequently, the carotid vascular tissue was collected for oil red O staining. Modeling was successful when foam cell formation was observed. Periodontal treatments were conducted twice, and euthanasiawas performed after the experiment. Moreover, double-carotid artery bifurcation was carried out to detect the expression of CRP and P. gingivalis. Immunohistochemical and 16sRNA semiquantitative methods were used to detect the CRP expression and the relative contents of P. gingivalis, respectively.ResultsImmunohistochemical results showed that the CRP-positive expression in groups B and C was significantly higher than that in group A (P＜0.05). The CRP-positive expression in other group C rats were significantly lower than that in group C1 (P＜0.05). The CRP-positive expression in group C2-2 was the lowest among the groups (P＜0.05). The relative quantity of P. gingivalis in group C1 was the highest and significantly higher than that in groups A and B (P＜0.05). The relative quantities of P. gingivalis in groups C2-1, C2-2, C3-1, and C3-2 were significantly lower than that in group C1 (P＜0.05), and the quantity in group C3-2 was the lowest (P＜0.05).ConclusionRats with CP associated with HL will increase the CRP expression and oral bacteria quantity on carotid artery, and lesions will gradually aggravate. Interventions, such as periodontal basic treatment and tooth extraction, could improve carotid artery lesions. The basic treatment with local and systemic anti-inflammatory drugs exerts the most satisfactory effect on local CRP expression. Tooth extraction with antibiotics is an effective method on reducing oral bacteria in carotid artery. Periodontal basic treatment associated with local and systemic antiflammatory drugs can obviously improve the effect.

hyperlipidemia; periodontitis; Porphyromonas gingivalis; C-reactive protein; periodontal basic treatment

R 781.4

A

10.7518/hxkq.2017.02.016

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81271144, 31050002); The Natural Science Foundation of Shanxi Province (2010011050-1). Correspondence: Ren Xiuyun, E-mail: rxy611@163.com.

2016-09-30；

2016-12-02

国家自然科学基金（81271144，31050002）；山西省自然科学基金（2010011050-1）

任秀云，副教授，博士，E-mail：rxy611@163.com

任秀云，副教授，博士，E-mail：rxy611@163.com