升降散对DM大鼠双歧杆菌、大肠杆菌及IL-6的影响

杜芬芬 孙晓泽 刘爱华*

1.河南中医药大学2014级硕士研究生，河南 郑州 450046；2.河南省中医院干部病房，河南 郑州 450002



升降散对DM大鼠双歧杆菌、大肠杆菌及IL-6的影响

杜芬芬1孙晓泽2刘爱华2*

1.河南中医药大学2014级硕士研究生，河南 郑州 450046；2.河南省中医院干部病房，河南 郑州 450002

目的：观察升降散对糖尿病大鼠双歧杆菌、大肠杆菌及IL-6的影响，探讨其作用机制。方法：取70只SD雄性大鼠，随机取10只作为正常对照组，余60只用高脂饲料喂养配合小剂量链脲佐菌素诱导建立糖尿病模型，取成模大鼠50只分为模型对照组、拜糖平组、升降散低剂量组、升降散中剂量组和升降散高剂量组，共分6组，每组10只，各组按相应药物剂量干预6周后，每组取8只大鼠样本采用Elisa法检测IL-6、INS，RealtimePCR技术进行细菌定量测定。结果：治疗前，模型对照组、拜糖平组、升降散低、中、高三个剂量组较正常对照组空腹血糖(FBG)、IL-6、INS及大肠杆菌数量均明显升高，但双歧杆菌数量明显减少；治疗前后，正常对照组及模型对照组组内各指标无明显变化。治疗后，拜糖平组及升降散低、中、高剂量FBG在2周、4周及6周均逐渐降低，且高于同时间正常对照组，低于同时间模型对照组(P<0.05)；IL-6、INS、大肠杆菌数量较模型对照组明显减少，但同时高于正常对照组(P<0.05)；双歧杆菌数量较模型对照组、正常对照组明显增多(P<0.01)。尤以升降散中剂量组增加双歧杆菌数量、降低大肠杆菌数量，抑制炎症因子、降低胰岛素含量效果明显。结论：升降散能通过增加益生菌数量，降低致病菌数量达到调整肠道菌群结构的目的，从而抑制炎症状态，降低血糖。其部分作用机制可能是通过调整肠道菌群、抑制炎症因子而减轻胰岛素抵抗(IR)，增加胰岛素利用率实现的。

升降散；糖尿病；双歧杆菌；大肠杆菌；IL-6 大鼠

随着大量实验研究证实肠道菌群与肥胖、糖尿病等代谢性疾病密切相关，肠道菌群已成为代谢性疾病防控的新方向。研究表明，肠道菌群失调可诱发慢性炎症进而诱发胰岛素抵抗，从而导致糖尿病发生，但其机制尚未十分明确。Zhang等[1]运用16Sr DNA高通量测序方法，发现机体代谢参数和菌群多样性两者间有明显的关联性。此为肠道菌群的结构可调控糖尿病的发病机制研究提供了证据。现有关于肠道菌群失调导致肥胖及2型糖尿病发生的研究，多数观点集中认为肠道乳酸菌、双歧杆菌等益生菌的减少与糖耐量异常密切相关[2-4]。中药升降散为临床调理脾胃气机的常用治疗大法，前期研究证实，其改善糖尿病的症状及降低血糖效果颇佳。本研究通过制作DM大鼠模型，观察升降散对DM大鼠肠道菌群(大肠杆菌、双歧杆菌)结构变化及相关炎症因子(IL-6)的影响，探讨其部分作用机制，为升清降浊法调整肠道菌群、改善糖尿病炎症状态、改善糖尿病临床预后提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 动物 SD雄性大鼠70只，SPF级，体重140～160g，由郑州大学动物实验中心提供，合格证号：41003100002297。清洁环境中饲养，室内温度维持在25℃左右，自由摄水。

1.2 药品与试剂 升降散药物组成(僵蚕10g，蝉蜕6g，姜黄6g，大黄3g)，药物购自河南省中医院，由三九颗粒制药提供，颗粒剂总重量为7g；拜糖平/阿卡波糖片(德国拜耳公司)；链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司)；SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2X))Fermentas公司)；Ex TaqTM、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker(TAKARA公司)；引物合成，擎科新业生物技术有限公司提供；基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司，批号：DP328)；大鼠IL-6 Elisa检测试剂盒(河南天驰生物有限公司，批号：CK-E30646R)。

1.3 仪器 血糖测定仪：稳豪倍优型血糖仪(强生医疗器械有限公司)；实时荧光定量PCR仪、荧光定量PCR管(ABI)；水平电泳仪、紫外分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司)。

2 方法

2.1 动物造模 70只大鼠普通饲料适应性喂养1周后，随机取10只作为正常对照组，标准饲料喂养，余60只予高脂饲料喂养至满8周后，腹腔注射STZ30mg/kg，正常组对照组注射等体积0.1mol/L无菌枸橼酸缓冲液。72h后测大鼠空腹血糖(禁食8～10h)，空腹血糖≥11.1mmol/L认为糖尿病大鼠造模成功[5]。剔除未成模及死亡大鼠10只。

2.2 分组与给药 50只成模大鼠按随机数字表法分为模型对照组、拜糖平组、升降散高、中、低剂量组及未造模的正常对照组，共6组，每组10只。拜糖平组每日灌胃70 mg·kg-1；升降散低、中、高剂量组，每日灌胃升降散(0.753，1.506，3.012 g·kg-1)，模型对照组与正常组每日灌胃等量生理盐水。每3天称体重1次，根据体重调整给药量。药物干预6周后进行各指标的观察检测。

2.3 标本采集与指标检测

2.3.1 一般情况 治疗期间观察大鼠精神状态、皮毛色泽、饮水量、尿量、体重等。

2.3.2 生化指标检测 每周血糖仪测空腹血糖值；治疗第6周末，4%的水合氯醛动物麻醉后取血标本，每组取8只样本进行ELISA法检测血清IL-6、INS。2.3.3 Realtime PCR技术测定双歧杆菌、大肠杆菌 每组取8只大鼠新鲜粪便样本进行检测,按试剂盒说明书每只大鼠取0.2g新鲜粪便进行基因组DNA提取，以其为模板做PCR扩增，扩增片段引物E.coli (95bp):E.coli F：CATGCCGCGTGTATGAAGAA,E.coli R：CGGGTAACGTCAATGAGCAAA ；Bifidobacterium genus (398bp):Bifi F：CAAGGGCATCTCCGTCA, Bifi R：GCGTTCAGGGTCTTCTCC。在PCR反应体系中，加入SYBR荧光染料，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

3 结果

3.1 一般情况观察 正常组大鼠精神状况良好，反应灵敏，饮食及尿量正常，毛色有光泽，体重稳定增加。其余各组注射STZ后明显消瘦，并出现多饮、多食、多尿、精神萎靡，毛色发黄无关泽等症状。

3.2 各组大鼠不同时间点FBG的比较 治疗前后，正常对照组及模型对照组组内血糖无明显变化，升降散低、中、高剂量组及拜糖平组血糖在2周、4周及6周逐渐降低，且均高于同时间正常对照组，低于同时间模型对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。 见表1。

表1 不同时间点各组大鼠血糖值比较

组别FBG/mmol/L0周2周4周6周正常对照组4.8600±0.804434.9000±0.553774.8200±0.549344.8100±0.48408模型对照组21.0200±4.64992a23.5900±4.13372a25.1444±4.10491a26.6444±3.42458a拜糖平组21.0600±4.12962a18.9600±4.63829ab18.0500±1.89927ab17.1100±2.37929abc升降散低剂量组20.1700±4.09092a18.4700±5.11470ab17.2800±4.41281ab15.3000±4.20714abcd升降散中剂量组21.3900±3.76665a17.4800±2.54200ab14.5700±3.05252abc12.0300±2.94469abcd升降散高剂量组21.2200±2.92035a17.4222±4.41214ab15.1111±4.42873abc14.0000±4.8716abcd

注：与同时间点正常对照组比较，aP<0.05；与同时间点模型对照组比较,bP<0.05；治疗前后组内比较，cP<0.05；升降散低、中、高剂量组与拜糖平组同时间点比较，dP<0.05。

3.3 各组大鼠治疗前后IL-6、INS的比较 治疗前，模型对照组、拜糖平组及升降散低、中、高剂量组较正常组IL-6、INS水平均明显升高(P<0.01)；治疗前后，正常对照组及模型对照组组内IL-6、INS水平无明显变化；治疗后，拜糖平组及升降散低、中、高剂量组IL-6、INS较模型对照组明显减少，但同时高于正常对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)。其中尤以升降散中剂量组IL-6、INS减少明显。见表2。

表2 各组大鼠治疗前后IL-6、INS比较

组别 IL-6/pg/mL INS/mU/L 治疗前治疗后治疗前治疗后正常对照组61.8567±7.1836262.1883±8.2433218.9100±2.6423519.1017±2.81536模型对照组 123.4833±10.87966a126.2150±8.69627a36.1600±3.15012a36.3417±3.07838a拜糖平组 124.2533±11.27015a105.4000±4.34205abc36.4600±2.74491a30.7633±1.64692abd升降散低剂量组 124.1483±10.54044a94.3500±5.93904abdef37.2250±3.57589a27.2283±1.39280abdef升降散中剂量组124.9217±9.98448a83.5533±3.67516abdef36.7567±2.71178a23.3433±1.98522abdef升降散高剂量组 123.9450±11.29428a94.0933±3.36112abdef36.6483±3.28817a26.5950±1.57260abdef

注：与正常对照组比较，aP<0.01；与模型对照组比较,bP<0.01；治疗前后组内比较，cP<0.05，dP<0.01；升降散低、中、高剂量组与拜糖平组比较，eP<0.01；升降散低、中、高剂量组间比较，fP<0.01。

3.4 双歧杆菌、大肠杆菌Realtime PCR定量分析 治疗前，模型对照组、拜糖平组及升降散低、中、高剂量组较正常组双歧杆菌明显降低、大肠杆菌量明显升高(P<0.01)；治疗前后，正常对照组及模型对照组组内乳酸杆菌、大肠杆菌量无明显变化；治疗后，模型对照组、拜糖平组及升降散低、中、高剂量组双歧杆菌量较模型对照组、正常对照组均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，大肠杆菌数量较模型对照组明显减少，但同时高于正常对照组(P<0.05)；其中尤以升降散中剂量组及拜糖平组升高乳酸杆菌量、降低大肠杆菌量明显。见表3。

表3 各组大鼠治疗前后双歧杆菌、大肠杆菌的比较

组别 双歧杆菌/109 大肠杆菌/1010 治疗前治疗后治疗前治疗后正常对照组6.3784±0.495506.5229±0.428268.4916±1.43562 8.4624±1.02783模型对照组3.5804±0.46232a 3.4362±0.55294a52.3229±14.08980a 52.8987±12.56822a拜糖平组3.7722±1.27251a 41.9090±14.68011ace50.7852±12.56644a 25.9502±11.61651bce升降散低剂量组3.6440±0.80915a 27.7655±7.42469acefg49.1260±11.08868a 34.6220±13.66367adef升降散中剂量组3.6572±1.22572a 37.5946±3.58789ace50.1154±11.50534a 27.4139±7.44699bce升降散高剂量组3.8067±0.99716a 30.6545±3.99961aceg52.6072±15.17083a 32.9847±12.69392ade

注：与正常对照组比较，aP<0.01，bP<0.05；与模型对照组比较，cP<0.01，dP<0.05；治疗前后组内比较，eP<0.01；治疗后升降散中剂量组与拜糖平组比较，fP<0.05；升降散低、高剂量组间比较，gP<0.05。

4 讨论

肠道菌群做为人体最大微生态系统，参与并影响着人体物质与能量代谢，目前多项研究表明，肠道菌群与糖尿病的发生发展密切相关，其作用机制可能为[6-9]：首先，肠道细菌可提高能量转化效率，能将食物中宿主自身不能分解的碳水化合转化为代谢终产物—短链脂肪酸(SC-FAs)，肠道菌群失调可诱发机体内SCFAs水平和构成发生异常，如此肠道抗炎症反应能力、脑肠肽激素分泌功能等受到影响，会引起胰岛细胞功能受损、胰岛素抵抗的发生；其次，高脂饮食可改变肠道细菌的环境，肠道菌群失调导致革兰阴性菌比例的增多、肠壁通透性增加或者肠道菌群移位，通过产生和吸收更多的 LPS，激活胰岛的低度慢性炎症，炎症可能通过多种途径导致胰岛β细胞结构受损与功能障碍，促进β细胞凋亡。同时，2型糖尿病本身亦会导致肠道菌群紊乱，削弱肠道屏障作用，刺激机体免疫系统所产生的IL-6、TNF-α等细胞因子，促使胰岛细胞功能进一步受损，如此形成恶性循环。因此，通过调控肠道菌群的组成或许能为糖尿病的治疗提供新策略。

中医强调以整体辨证论治，对此单方面的研究甚少，对其病因病机的研究散见于消渴病的文献中。总结前人对其病因的认识大致为禀赋虚弱、饮食失节、情致失调及劳欲过度，其病机以阴虚燥热为主。但疾病是发展的，病因病机亦是发展的。刘爱华教授基于多年对DM临床观察和总结的基础上，应用中医病因病机学基本理论、继承脾胃学家李东垣、国医大师李振华 “升清降浊”学说，并在查阅相关的文献资料，运用类比、归纳、演绎多种方法，经过较严密的逻辑思维过程，创新提出“脾失升清，浊毒下陷”之假说，认为DM的发病与脾胃气机升降失常、痰浊瘀毒逆乱有关，而且认为“脾失升清，浊毒下陷”气机升降是根本。故用升降散，以僵蚕、蝉蜕、姜黄、大黄，共研细末，以黄酒、蜂蜜为引导，蝉蜕、僵蚕升阳中之清阳；片姜黄、制大黄降阴中之浊阴，则杂气之流毒顿消矣。现代药理亦研究证实升降散具有抗炎、抗病毒、抗过敏、解痉，利胆，抗惊厥，调节免疫等功能[10]。

本实验结果显示：治疗前，模型对照组、拜糖平组、升降散低、中、高三个剂量组较正常对照组空腹血糖(FBG)、IL-6、INS及大肠杆菌数量均明显升高，但双歧杆菌数量明显减少；治疗前后，正常对照组及模型对照组组内各指标无明显变化。治疗后，拜糖平组及升降散低、中、高剂量FBG在2周、4周及6周均逐渐降低，且高于同时间正常对照组，低于同时间模型对照组(P<0.05)；IL-6、INS、大肠杆菌数量较模型对照组明显减少，但同时高于正常对照组(P<0.05)；双歧杆菌数量较模型对照组、正常对照组明显增多(P<0.01)。尤以升降散中剂量组增加双歧杆菌数量、降低大肠杆菌数量，抑制炎症因子、降低胰岛素含量效果明显。由此推测，升降散能通过增加益生菌数量，降低致病菌数量达到调整肠道菌群结构的目的，从而抑制炎症状态，减轻胰岛素抵抗，增加胰岛素利用率而降低血糖。

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Effects of Shengjiangsan on Bifidobacterium,e.coli and IL - 6 in DM Rats

DU Fenfen1SUN Xiaoze2LIU Aihua2*

1.The graduate student of 2014,Henan university of traditional Chinese medicine, Zhengzhou 4500046,China;2.The vip ward of henan province Chinese medicine hospital,Zhengzhou 450002,China

Objective To observe the effect and the mechanism of Chinese herbal medicine on Bifidobacterium, Escherichia coli and IL-6 in diabetic rats. Methods 70 SD male rats, 10 rats as normal control group, only more than 60 high fat diet combined with low dose of streptozotocin induced diabetic model was established, the model 50 rats were divided into model group, Bai Tangping group, Shengjiangsan low dose group, middle dose group Shengjiangsan Shengjiangsan and high dose groups were divided into 6 groups, 10 rats in each group, each group according to the corresponding dose of drug for 6 weeks, 8 rats from each group of samples was detected by Elisa IL-6, INS Realtime, PCR technology for quantitative determination of bacteria. Results Before treatment, model group and acarbose group, Shengjiangsan low, medium and high dose groups compared with normal control group, fasting blood glucose (FBG), IL-6, INS and the number of Escherichia coli were significantly increased, but the number of bifidobacteria was significantly reduced; before and after the treatment, the normal control group and model control group each index in the group had no obvious change. After treatment, acarbose Shengjiangsan group and low, middle and high dose of FBG in 2 weeks, 4 weeks and 6 weeks were gradually decreased, and higher than that of the normal control group, compared with model control group (P<0.05); IL-6, INS, the number of Escherichia coli than the model control group was significantly reduced, but at the same time higher than the normal control group (P<0.05); the number of bifidobacteria compared with model control group, normal control group increased significantly (P<0.01). Especially in the middle dose group, the number of bifidobacteria increased, the number of E.coli decreased, the inflammatory factors and insulin content were decreased significantly. Conclusion By increasing the number of probiotic bacteria, reducing the number of pathogens to adjust the structure of intestinal flora, thereby inhibiting the inflammatory state, reducing blood glucose. Part of its mechanism may be to reduce insulin resistance (IR) and increase insulin utilization by regulating intestinal flora and inhibiting inflammatory factors.

Shengjiangsan; DM rats; bifidobacterium; e. Coli; IL-6

杜芬芬(1991-)，硕士研究生在读，研究方向为内分泌及其代谢性疾病。E-mail:13598834275@163.com

刘爱华(1957-)，主任医师，研究生导师，研究方向为内分泌及其代谢性疾病。E-mail:liuaihua666888@sina.com

R

A

1007-8517(2017)08-0035-04

2017-2-20 编辑：陶希睿)