畲药“十二时辰”水煎剂的急性毒性实验研究

张继州 周春权 李细彬 雷华杰 韩 静 贺肇东 胡 娟1,3

1. 福建省中医药研究院，福建 福州 350003；2.福建省宁德市闽东畲族青草药发展协会，福建 宁德 352100；3.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122



实验研究

畲药“十二时辰”水煎剂的急性毒性实验研究

张继州*周春权*李细彬2雷华杰2韩 静*贺肇东*胡 娟1,3*

1. 福建省中医药研究院，福建 福州 350003；2.福建省宁德市闽东畲族青草药发展协会，福建 宁德 352100；3.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122

目的：研究畲药“十二时辰”水煎剂对小鼠的急性毒性，以初步评价其安全性。方法：以不同剂量“十二时辰”水煎剂对小鼠灌胃，观察毒性症状，记录死亡情况，并计算最大耐受量(MTD)、最小致死量(MLD)及半数致死量(LD50)的值。结果：小鼠口服“十二时辰”水煎剂的最大耐受量(MTD)为27.44g/kg，最小致死量(MLD)为39.2g/kg，半数致死量(LD50)为60.08g/kg。结论：“十二时辰”临床应用时，需严格控制口服剂量。

十二时辰；急性毒性；最大耐受量；最小致死量；半数致死量

“十二时辰”为毛茛科植物重瓣铁线莲ClematisfloridaThunb. var．plenaD.Don的干燥根[1]，为福建福安畲医习用药。《福安畲医畲药》记载，其性温、味辛，具有通经活络、通关窍、怯风除湿、活血止痛、理气通便、利尿、解毒等功效，主治跌打损伤，关节肿痛，虫蛇咬伤[2]；《中华本草》记载其“味苦、微辛; 性温，小毒，归肝、脾、肾经，可利尿、通络、理气通便、解毒”，主治风湿性关节炎、小便不利、闭经、便秘腹胀、风火牙痛、眼起星翳、虫蛇咬伤、黄疸等[3]，是一味地方特色鲜明的民族药，值得进一步研究并加以开发应用。关于十二时辰的化学成分，近年已有相关报道[4-5]，其主要活性成分包括棕榈酸及其甲酯、乙酯以及齐墩果酸等。但迄今为止，对于“十二时辰”及其原植物重瓣铁线莲的安全性评价还未见文献报道。研究通过小鼠口服不同剂量“十二时辰”水煎剂，观察毒性症状，记录死亡情况，并计算最大耐受量(MTD)、最小致死量(MLD)及半数致死量(LD50)的值，为其临床安全使用奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试药 YP502N电子天平(上海精密科学有限公司)、WK2102电磁炉(美的)，“十二时辰”生药(批号：20160501)购买自福建福安。

1.2 实验动物 清洁级昆明种小鼠，雌雄各半，体重20～22g，购自上海斯莱克实验动物中心(合格证号：SCXK(沪)2012-0002)，光暗周期12/12 h(光照时间8∶00～20∶00)下饲养，自由饮食，室温保持 18～22℃，相对湿度 40%～70% ，实验前适应性喂养3d。

2 方法

2.1 水煎剂制备 用电子天平称取“十二时辰”药材400g，加水12倍体积煎煮1h，再先后加水10倍体积和8倍体积各煎煮0.5h，合并三次煎煮液，浓缩至200mL，即得2g/mL浓缩液备用，用时再用蒸馏水配成相应浓度。2.2 最大耐受量和最小致死量的测定 预试验中，80g/kg剂量的“十二时辰”水煎剂灌胃造成小鼠全部死亡，而8g/kg及0.8g/kg两剂量无死亡。因此正式试验中，在80g/kg和8g/kg剂量之间，以0.70等比组距，设置5个剂量组，其剂量分别为56g/kg、39.2g/kg 、27.44g/kg、19.2g/kg、13.44g/kg。

实验动物随机分为5个实验组及1个空白对照组，每组10只，雌雄各半，实验前禁食不禁水16h。各实验组按0.4mL/10g体重灌胃给予上述剂量“十二时辰”水煎剂，空白对照组给予等体积的蒸馏水，观察其毒性症状，记录死亡情况，确定小鼠口服“十二时辰”水煎剂的最大耐受量(MTD)和最小致死量(MLD)。

2.3 LD50的测定 参考2.2结果，经预试验，得出小鼠口服“十二时辰”水煎剂的100%致死量(Dm)为64 g/kg，0%致死量(Dn)为32.8g/kg，两者之比接近2倍。故根据改良寇氏法(Kärber氏法)[6]，参考Dm和Dn，以0.85等比组距，设置6个剂量组，其剂量分别为75.3g/kg、64g/kg、54.4g/kg、46.2g/kg、39.3g/kg、33.4g/kg。

实验动物随机分为6个实验组及1个空白对照组，每组10只，雌雄各半，实验前禁食不禁水16小时。各实验组按0.4mL/10g体重灌胃给予上述剂量“十二时辰”水煎剂，空白对照组给予等体积的蒸馏水，观察其毒性症状，记录死亡情况，并计算小鼠口服“十二时辰”水煎剂的半数致死量(LD50)。

2.4 统计描述及LD50计算方法 实验数据以各实验组动物死亡率表示，LD50采用改良寇氏法计算，计算公式如下：

LD50=log-1{Xm-i[∑p-(3-pm-pn)/4]}

其中：Xm为最大剂量组剂量的对数；i为相邻两组高剂量与低剂量之比的对数；p为各组动物的死亡率；∑p为各组p值之和；pm为最高剂量组死亡率；pn为最低剂量组死亡率。

LD50的95%可信区间计算公式如下：

其中：i为相邻两组高剂量与低剂量之比的对数；p为各组动物的死亡率；n为每组的动物数量。

3 结果

3.1 一般情况观察 空白对照组小鼠精神良好，活动正常，无死亡。“十二时辰”水煎剂组随剂量升高，有静伏不动、活动减少，死亡前抽搐等毒性现象。

3.2 最大耐受量和最小致死量的测定 由表1可知，小鼠口服“十二时辰”水煎剂的最大耐受量(MTD)为27.44g/kg，最小致死量(MLD)为39.2g/kg。

表1 小鼠口服不同剂量“十二时辰”水煎剂的死亡情况

3.3 “十二时辰”水煎剂的LD50的测定 各组死亡情况见表2.根据改良寇氏法，将表2数据代入计算公式得：LD50=60.08g/kg；LD50的95%可信区间为54.42～65.73g/kg。

表2 小鼠口服不同剂量“十二时辰”水煎剂的死亡情况

4 讨论

急性毒性试验是药物安全性评价的第一步，为后续的长期毒性试验、特殊毒性试验及药效学、药理学研究中剂量选择和指标设计提供重要的参考依据，同时也为临床安全应用奠定基础。

半数致死量LD50是药物的重要特征性参数,准确测定LD50是合理用药、安全用药的重要前提[6]。本次试验满足三个条件：①反应量大致呈正态分布；②给药浓度按照等比级数排列；③各组动物数相等，故采用改良寇氏法(Kärber氏法)作为LD50的计算方法。然而单纯依靠LD50作为急性毒性指标具有一定的缺陷，例如，无法反映不引发动物死亡的剂量与引发动物死亡的剂量之间的范围。因此，配合最大耐受量(MTD)及最小致死量(MLD)等相关数据，可以反映药物毒作用带的宽度，更全面地表示药物的毒性。研究中，小鼠口服“十二时辰”水煎剂的最大耐受量(MTD)为27.44g/kg，最小致死量(MLD)为39.2g/kg，半数致死量(LD50)为60.08g/kg，其95%可信区间为54.42～65.73g/kg。按照药理实验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算，半数致死量(LD50)的值相当于60kg体重成人服用292.0g生药[7]，根据化学物质的急性毒性分级标准，该药材属低毒药材。LD50约为MLD的两倍，说明口服“十二时辰”水煎剂后，自出现小鼠死亡的最低剂量至半数小鼠死亡的剂量存在一定距离，毒剂量带有一定的宽度。此外，小鼠口服“十二时辰”后的毒性现象可知，在致死剂量下其毒作用较为明显，但具体的机制以及靶器官尚需要进一步实验研究加以确认，并与同为铁线莲属的其他药用植物加以对比。

[1]黄泽豪，张月玲. 畲药十二时辰的本草考证[J]. 中国民族民间医药，2014,23(1):2-3.

[2]钟隐芳．福安畲医畲药[M]．福州:海风出版社，2010:109-110．

[3]《中华本草》编委会. 中华本草(第三辑) [M]. 上海:上海科学技术出版社，1999:198．

[4]黄泽豪，郭家欣，沈贤娟. 畲药十二时辰挥发油的GC-MS分析[J]. 福建中医药，2014，45(1)：52-53.

[5]刘知远，沈廷明，李细彬，等.HPLC法测定畲药十二时辰中活性成分齐墩果酸的含量[J]. 中国药师，2016，19(9)：1758-1760.

[6]周立国. 药物毒理学[M]. 北京：中国医药科技出版社，2009：141-142，131-132.

[7]黄继汉，黄晓晖，陈志扬，等.药理实验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[J]. 中国临床药理学与治疗学，2004，9 (9):1069．

福建省属公益类科研院所基本科研专项(2015R1035-6)；福建省科技厅对外合作项目(2017I0006)；2016年度福建省“省级重点扶贫县及革命老区苏区引智专项计划”资助(2016021)。

张继州(1989-)，男，汉族，硕士，实习研究员，研究方向为中药药理。E-mail:812939996@qq.com

胡娟(1962-)，女，土家族，硕士，教授，研究方向为中药药效物质基础。E-mail：huj@fjtcm.edu.cn

R285.5

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1007-8517(2017)08-0027-03

2017-02-17： 编辑：梁志庆)