电针抗下肢肌萎缩的频率组合优化及其机制的初步研究

庄伊洢,黄晓卿,叶笑然,陈玄



电针抗下肢肌萎缩的频率组合优化及其机制的初步研究

庄伊洢,黄晓卿,叶笑然,陈玄

(福建省中医药研究院,福州 350003)

目的 筛选电针治疗肌萎缩的优化电脉冲参数并探讨机理。方法 SD大鼠40只,制作下肢肌萎缩模型后随机分为A组(模型组,不电针)、B组(波宽0.5 ms,频率2 Hz)、C组(波宽200 ms,频率2 Hz)、D组(波宽200 ms,频率1/2/3 Hz)。电针足三里和承山穴,共4个疗程。观察坐骨神经功能指数(SFI)、腓肠肌湿重比(GW)、腓肠肌纤维横截面积比(GC)、腓肠肌细胞直径比(GD)和腓肠肌细胞凋亡指数(AI)的变化。结果 与A组比,C组和D组的SFI、GW、GC明显增大,AI明显减小(＜0.05);与B组比,C组、D组的AI明显减小(＜0.05);与C组比,D组的AI明显减小(＜0.05)。结论 以波宽200 ms,频率1/2/3 Hz的电脉冲延缓肌萎缩为优化电针参数,其机制与抑制肌细胞凋亡有关。

针刺;电针;波宽;频率;肌萎缩;细胞凋亡;大鼠

电针疗法是通过电针仪实现的,电针仪以电针参数刺激为主[1-3]。电针参数中的频率代表单位时间内输出的电脉冲个数。根据频率组成的差异,目前通用各型电针仪的输出波型有连续波、疏密波和断续波3种[4-5]。连续波是指频率为一固定值的脉冲串;疏密波是指两频率交替的脉冲串;断续波是指固定频率输出强度断续的脉冲串,“断”时的强度为0[6]。这3种波型实质上均属于规则性脉冲串。在规则性频率电刺激下,穴区下的神经和组织会发生适应,适应后组织对刺激的应答力下降[7],容易引起针感的耐受;而频率输出值不固定的不规则频率刺激较规则频率的刺激保持应答时间更长[8]。

电刺激可以使肌肉节律性收缩,防止肌萎缩进程。肌萎缩不伴随坏死的细胞体积减少,细胞凋亡亦呈现细胞体积减少,目前电针治疗肌萎缩的机理不明。不规则的频率刺激可以抵抗针感耐受,那么,是否也能够同时提高电针抗肌萎缩的疗效?通过探讨电针抗肌萎缩过程与细胞凋亡的变化关系是否可以阐明电针治疗肌萎缩的机理呢?本文通过变化的频率组合电参数来开展电针抗肌萎缩的疗效观察,并初步探讨相关机理。

1 材料与方法

1.1 模型及分组

40只雄性SD大鼠以坐骨神经切断法制作右侧下肢肌萎缩模型[9],左侧下肢假手术。造模后大鼠按随机数字表法分为A组(模型组,不电针)、B组、C组、D组,每组10只。

1.2 电针

正常喂养4星期后,根据随证取穴及近部取穴[6]的原则,电针大鼠患侧足三里和承山穴。每日1次,每次30 min,5次1个疗程,疗程间隔2 d,共4个疗程。B组以佳健牌CMNS6-1型电针仪为刺激源,波宽0.5 ms,频率2 Hz;C组、D组以计算机控制式电针仪为刺激源,C组波宽200 ms,频率2 Hz,D组波宽200 ms,频率1/2/3 Hz(保证输出频率平均值为2 Hz),随机交替,循环输出。由小至大调节各组强度,以大鼠下肢肌肉在肉眼下轻微收缩、跳动,针柄明显颤动为度。

1.3 观察指标

1.3.1 坐骨神经功能指数(SFI)

用拍照法[10]和墨水法[11]获取足底图形来检测坐骨神经功能。①足印长度(print length,PL),足印的最长距离,即从足跟到足尖。②足趾宽度(toe spread,TS),第1趾到第5趾连线距离。③中间足趾宽度(intermediary toe spread,IT),第2趾到第4趾连线距离,代入Bain公式检测SFI。Bain公式为SFI=[109.5(eTS－nTS)/nTS－38.3(ePL－nPL)/nPL＋13.3(eIT－nIT)/nIT]－8.8(前缀e代表病损侧,前缀n代表健侧)。

SFI的范围:SFI=0为正常,SFI＜0为不同程度的损伤。

1.3.2 肌湿重(GW)、肌纤维横截面积(GC)、肌细胞直径(GD)及细胞凋亡指数(AI)[10]

取各组大鼠双下肢腓肠肌,称量肌湿重。石蜡包埋处理后,分别对同一肌组织的2个蜡块沿肌纤维横、纵切面方向进行切片。横切片HE染色,纵切片TUNEL染色。

每张切片随机选择5个不重复高倍视野(×40)在Image-Pro Plus图像分析系统中处理。横切片每个视野分别检测腓肠肌纤维横截面积及细胞直径,纵切片每个视野计数阳性细胞核数和总细胞核数,AI=阳性细胞核数/总细胞核数;均求平均值。

1.4 统计学方法

GW、GC、GD均以患侧与健侧的测定值之比表示。各组的SFI、GW、GC、GD和患侧AI均以均数±标准差表示;采用单因素方差分析进行统计。以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

表1中,与A组比,拍照法获得的C组、D组的SFI明显增大(＜0.05)(图1)。表2中,与A组比,C组、D组的GW、GC明显增大(＜0.05);表2中,与A组比,C组、D组的患侧AI明显减小(＜0.05);与B组比,C组、D组的患侧AI明显减小(＜0.05);与C组比,D组患侧AI明显减小(＜0.05)(图2、图3)。

表1 电针足三里穴-承山穴对下肢肌萎缩大鼠下肢功能的影响 (±s)

表1 电针足三里穴-承山穴对下肢肌萎缩大鼠下肢功能的影响 (±s)

组别n坐骨神经功能指数SFI 墨水法拍照法 A组10﹣67.48±12.55﹣73.45±9.25 B组10﹣61.64±15.34﹣64.98±9.53 C组10﹣55.52±11.89﹣56.57±9.641) D组10﹣64.52±13.17﹣57.96±9.311)

注:与A组比较1)＜0.05

表2 电针足三里穴-承山穴对下肢肌萎缩大鼠腓肠肌细胞细胞凋亡的影响 (±s)

表2 电针足三里穴-承山穴对下肢肌萎缩大鼠腓肠肌细胞细胞凋亡的影响 (±s)

组别n腓肠肌湿重比GW腓肠肌纤维横截面积比GC腓肠肌细胞直径比GD患侧腓肠肌细胞凋亡指数AI(%) A组100.278±0.0740.450±0.1390.463±0.18720.21±1.13 B组100.305±0.0830.514±0.1720.527±0.21016.61±1.84 C组100.364±0.0781)0.658±0.2311)0.707±0.19511.27±2.121)2) D组100.374±0.0851)0.638±0.1101)0.710±0.2008.34±1.981)2)3)

注:与A组比较1)＜0.05;与B组比较2)＜0.05;与C组比较3)＜0.05;健侧腓肠肌细胞凋亡指数AI(%)≈0

图1 大鼠电针4个疗程后拍照法获得的足底图形(左侧为健侧足底,右侧为患侧足底)

A组(健侧) B组(健侧) C组(健侧) D组(健侧) A组(患侧) B组(患侧) C组(患侧) D组(患侧)

A组(健侧) B组(健侧) C组(健侧) D组(健侧) A组(患侧) B组(患侧) C组(患侧) D组(患侧)

3 讨论

电针疗法是延缓肌萎缩及僵硬的有效办法[12-13]。通用各型电针仪的输出波宽为0.2～0.5 ms,属于短脉冲波宽。研究表明[10]电脉冲100 ms和200 ms的宽波较0.5 ms的短波宽防治肌萎缩效果较好。本文选取200 ms宽波作为电针参数。

已知通用各型电针仪输出频率参数均属于规则性频率,故易发生适应反应。针对骨骼肌萎缩的疾病,不规则性的频率刺激可以使萎缩的肌肉产生不同节律的收缩,达到延缓萎缩的目的[8,14]。而临床电针治疗中针感常伴有减弱甚至消失[15],这与规则性频率促使神经发生适应,造成局部对刺激的效应降低有关。有学者[16]采用多种频率交替且不规则的电针刺激身体不同体区的穴位,结果显示不规则频率能明显延长电针针感的持续时间。表1、表2结果显示,与C组比,D组的肌组织学和肌细胞凋亡指数的改善都更显著,说明D组的疗效优于C组,表明采用200 ms波宽并且脉冲频率为低频不规则的电针刺激疗效优于200 ms波宽,其原因可能与上述针感的持续时间延长相似。

SFI称为坐骨神经功能指数,可以反应大鼠下肢的整体功能,是公认的评定坐骨神经功能损伤和康复的指标,其获取方法常用拍照法[10]和墨水法[11]。1993年,我国学者沈宁江采用墨水法测量Bain公式中的SFI,该法在国内被大量引用。具体操作是制作60 cm× 10 cm×10 cm的长方形通道,内底铺上匹配的白纸,用墨水涂抹大鼠的双脚掌,令大鼠自行走过通道,白纸面上会留下足印,显示出足底各足趾间距等参数。但是该法获得的足底印图形往往因步行中拖带造成足底印迹变形(如足印拖长)或因着色墨水不够而出现足趾或足迹的缺失,这些问题使得墨水法测得的足底印迹数据参数难以完整(图4)。本文引用了2000年建立的拍照法获得大鼠的足底图形,避免了墨水法的不足[17]。表1结果可见,墨水法测的各组SFI结果没有统计学意义;拍照法测的SFI中,与A组比,B组的SFI无显著性差异;C组、D组的SFI明显增大。说明采用200 ms波宽及200 ms波宽并且频率为低频不规则的电针都可以更好地改善下肢神经损伤的步行功能。

图4 墨水法测SFI的大鼠足印图(×4)

腓肠肌湿重比(GW)、腓肠肌纤维横截面积比(GC)、腓肠肌细胞直径比(GD)以及细胞凋亡指数(AI)是肌肉组织细胞学的经典指标,可以反应电针治疗肌萎缩的疗效。表2中可见,与A组比,B组GW、GC和GD均无明显增大;C组和D组GW、GD明显增大,说明C组和D组疗效优于B组,表明200 ms波宽及200 ms波宽并且 频率为低频不规则的电针刺激都可以提高肌萎缩的组织学的疗效。各组AI均为患侧测量值,与A组比,B组AI无明显减小;C组和D组AI明显减小,表明200 ms波宽能抑制肌细胞凋亡。与C组比,D组AI明显减小,表明加宽波并加上电针频率的变化可以更进一步提高电针抑制肌细胞凋亡的效果。表2中A组行自左而右看,GW、GC和GD均小于1,其AI值约20%,这表明肌组织萎缩明显且伴随发生了肌细胞凋亡。B组、C组、D组AI值均小于17%,即小于A组。可见,电针治疗后会造成肌萎缩组织学变化的减轻伴随细胞凋亡的减轻。表2中各组GW、GD和AI列自上而下看,与B组比,C组GW、GD明显增大,AI明显减小,说明C组疗效好于B组,这表明200 ms波宽的疗效优于0.5 ms。与C组比,D组GC和AI改善都更显著,这表明采用200 ms波宽并且频率为低频不规则的电针刺激的疗效优于200 ms波宽。电针治疗的效应一方面使肌萎缩组织学变化的减轻,另一方面使伴随的细胞凋亡程度减轻。各组患侧AI结果表示,宽波电针组的疗效优于常规电针,而宽波变频电针的疗效优于宽波电针的疗效。可见,细胞凋亡参与肌萎缩,也参与电针延缓肌萎缩的过程。

综上所述,电脉冲参数中以宽波且低频变化频率的电针参数具有更好的延缓肌萎缩的效果,并能够抑制细胞凋亡,该效果明显优于常规电针仪的电脉冲。本研究暂不能明确肌萎缩与细胞凋亡的先后关系;研究结果提示有可能通过阻断凋亡的信号通路,达到延缓肌萎缩的疗效。

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A Preliminary Study of the Optimal Frequency Combination and Mechanism of Electroacupuncture Treatment for Lower Limb Myatrophy

350003,

Objective To sift out the optimized electric pulse parameters for electroacupuncture treatment for lower limb myatrophy and explore the mechanism of its treatment. Method A model of lower limb myatrophy was made in 40 SD rats. The rats were then randomized to groups A (model group without electroacupuncture), B (a pulse duration of 0.5 ms and a frequency of 2 Hz), C (a pulse duration of 200 ms and a frequency of 2 Hz) and D (a pulse duration of 200 ms and a frequency of 1/2/3 Hz). Points Zusanli(ST36) and Chengshan(BL57) were given electroacupuncture for four courses of treatment. The sciatic function index (SFI), gastrocnemius muscle wet weight ratio (GW), gastrocnemius muscle fiber cross-sectional area ratio (GC), gastrocnemius muscle cell diameter ratio (GD) and gastrocnemius muscle cell apoptosis index (AI) were determined. Result SFI, GW and GC increased significantly and AI decreased significantly in groups C and D compared with group A (＜0.05). AI decreased significantly in groups C and D compared with group B (＜0.05). AI decreased significantly in groups D compared with group C (＜0.05). Conclusion A pulse duration of 200 ms and a frequency of 1/2/3 Hz are the optimized electric pulse parameters for electroacupuncture delaying myatrophy. Its mechanism is related to inhibiting myocyte apoptosis.

Acupuncture; Electroacupuncture; Pulsewidth; Frequency; Myatrophy; Apoptosis; Rats

1005-0957(2017)04-0473-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.04.0473

2016-11-20

国家自然科学基金面上项目(81373733);福建省属公益类科研院所基本科研专项(2015R1035-4)

庄伊洢(1988—),女,实习研究员,硕士,Email:zyy.roy@hotmail.com

陈玄(1979—),女,助理研究员,硕士,Email:chenxuanfz@aliyun.com