饲料中添加维生素A、C和E对克氏原螯虾生长和免疫力的影响

邵光明，谭红月，王玉凤

（华中师范大学生命科学学院，遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，湖北 武汉 430079）

饲料中添加维生素A、C和E对克氏原螯虾生长和免疫力的影响

邵光明，谭红月，王玉凤

（华中师范大学生命科学学院，遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，湖北 武汉 430079）

维生素在甲壳动物的存活、生长、繁殖过程中起重要作用。本研究采用正交设计实验，研究了维生素A、维生素C和维生素E的添加量对克氏原螯虾（Procambarus clarkii）幼虾生存、生长和免疫的影响。研究设立三个因子A、B、C，分别为维生素A、维生素C、维生素E的添加量。每个因子设3个水平，维生素A添加量的3个水平为：0.0048、0.0054、0.006%；维生素C添加量的3个水平为：0.02、0.05、0.08%；维生素E添加量的3个水平为：0.02、0.04、0.06%。极差分析结果表明，克氏原螯虾幼虾成活率最高时的因子水平组合为：A3B1/B3C2；增重率最大时的因子水平组合为：A3B2C2；丙二醛（MDA）含量、超氧化物气化酶（SOD）活性和SOD基因表达水平最低时的因子组合水平都为：A2B1C1；酚氧化酶（PO）活性最高时的因子水平组合为：A3B2C1；谷胱甘肽过氧化物酶基因GPx表达水平最低时的因子水平组合为：A3B1C1。将克氏原螯虾幼虾的成活率和增重率作为主要考虑因素，综合考虑免疫指标及成本因素，我们建议在本次实验设计的条件中，选择A3B1C2作为最佳组合方案，即维生素A添加量为0.006%、维生素C添加量为0.02%、维生素E添加量为0.04%时，最有利于克氏原螯虾幼虾的存活、生长，提高其免疫力。

克氏原螯虾；维生素；存活；生长；免疫

克氏原螯虾（Procambarus clarkii）又称淡水小龙虾，隶属于甲壳纲、十足目、蝲蛄科、原螯虾属，是我国一种重要的淡水经济虾类。由于克氏原螯虾肉味鲜美，营养丰富[1]，越来越受到消费者的喜爱，市场价值不断攀升，仅湖北省每年产值就超50亿元。研究组前期对克氏原螯虾的开口饵料进行过研究[2]，然而有关饲料中添加多种维生素对幼虾影响的研究还未见报道，该研究的目的是通过研究维生素A、C、E添加量对克氏原螯虾幼虾存活、生长、免疫力的影响，为克氏原螯虾幼虾的配合饲料研制提供理论指导。

1 材料和方法

1.1 实验虾

实验用克氏原螯虾幼虾为在华中师范大学克氏原螯虾研究基地饲养孵化出来的虾。随机选取2月龄大的克氏原螯虾，平均体质量（0.518±0.009）g，体形相近，肢体健全，健康活泼。

1.2 实验方法

1.2.1 饲料配制和幼虾喂养将三个因子（维生素A、C、E添加量）各设3个水平，维生素A（VA，因子A）的3个水平分别为：0.0048%、0.0054%和0.0060%；维生素C（VC，因子B）的3个水平分别为：0.02%、0.05%和0.08%；维生素E（VE，因子C）的3个水平分别为：0.02%、0.04%和0.06%。根据正交设计L18（37）表设计了18种组合（表1），空列用于估算实验误差。实验结果进行极差（直观）分析，极差值为正交设计中每个因子3个水平中的最大平均值和最小平均值之差（kmax-kmin）[3-4]。

表1 正交设计L18（37）的因子水平表

将各因子按照各水平分别添加到基础饲料中，安排了18种饲料配方，具体配方见表2，糊精用来补平差额部分。饲料混合均匀后，用压面机压制成长条，再切成2 mm左右长的颗粒，于烘箱内60℃烘干8 h，然后密封贮存在4℃冰箱内备用。饲料在实验用水中3 h内不散。将实验虾分为18组，每组25只。实验时每日喂食两次，分别为8：00—9：00，17：00—18：00，喂食量以第二次喂食时略有剩余为准。每日吸去水族箱内残饵与排泄物，并换水。充氧泵持续充氧，水温19℃左右。50 d后测定生长指标（成活率、增重率）、免疫相关指标及免疫相关基因的表达量。

其中，各组相同的饲料成分为：小麦粉，15%；玉米粉，15%；鱼粉，20%；黄豆粉，40%；鱼油，2%；矿物质，1.5%。矿物质的组成（质量百分比）如下：KCl，2.8%；NaH2PO4，10%；KH2PO4，21.5%；Ca（H2PO4）2· 2H2O，26.5%；CaCO3，10.5%；Ca-lac，16.5%；MgSO4· 7H2O，10%；CoCl2·6H2O，0.176%；CuCl2，0.051%；KI，0.058%；MnSO4·4H2O，0.143%；柠檬酸铁，0.061%；ZnSO4·7H2O，0.511%；AlCl·6H2O，1.2%。

表2 饲料配方%干重

1.2.2 生长指标的测定实验结束时，用电子天平测量克氏原螯虾幼虾的体质量（精确到0.001 g）。克氏原螯虾幼虾的成活率、增重率按公式计算：

存活率（%）=100×（实验结束时幼虾的数量/实验开始前幼虾的数量）；

增重率（%）=100×（实验结束时幼虾体质量－实验开始前幼虾体质量）/实验开始前幼虾体质量。

产生抗菌活性物质抑制植物病原菌生长是植物内生菌作为生防菌的重要作用机理之一[11,12]。内生菌产生的抗菌活性物质种类繁多[13]，有抗菌肽、脂肽、生物碱、酚类、醌类、萜类、几丁质酶、葡聚糖酶和挥发性物质等[14～16]。其中，脂肽、几丁质酶、葡聚糖酶等主要由内生细菌产生；生物碱类、肽类、甾体类、萜类、酚类、醌类、脂肪族类、异香豆素类的抗菌物质主要由内生真菌产生；内生放线菌则主要产生抗生素类。

1.2.3 免疫相关指标的测定实验结束后，取虾肝胰腺和鳃放入400 μL的双蒸水中，冰上匀浆，4℃8，000 g离心15 min，取上清，放入-80℃冰箱中备用。

蛋白浓度的测定参照南京建成试剂盒说明书，先测定各样品的蛋白浓度、然后根据其浓度加水稀释，使不同样品的浓度大致一致，且浓度在试剂盒说明书中规定的范围，最后再测各样品的蛋白浓度。丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定参照南京建成试剂盒说明书。酚氧化酶（PO）活性测定方法见参考文献[5]。

1.2.4 免疫相关基因表达量的测定RNA提取和基因表达分析参考本研究组前期的方法[6]。简而言之，用Trizol RNA提取试剂盒（invitrogen公司）提取果蝇肝胰腺的总RNA。在测定RNA浓度后，取约5 μg RNA，用Oligo（dT）引物（TaKaRa）及逆转录酶M-MLV（Invitrogen公司）合成cDNA第一链。用BIO-RAD荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR。反应体系包括：SYBR Green II Dye（2×）（TaKaRa）10 μL，cDNA模板2 μL，1 μM上下游引物（引物序列见表3），加dd H2O补至20 μL。反应条件为：95℃预热2 min，再经过40个循环，每个循环过程为95℃5 s，58℃20 s，72℃10 s。反应结束后，读取Ct值。利用荧光曲线值和Ct值就可以计算目的基因SOD和GPx基因的相对表达量，以actin基因为内参。基因相对表达量用2-△Ct表示，其中△Ct=（Ct目的基因Ct内参）。每种样品做3个生物学重复。

表3 实验所用引物

2 结果

2.1 维生素A、C、E的添加量对克氏原螯虾幼虾成活率和增重率的影响

不同维生素添加量组合下，克氏原螯虾幼虾的成活率不同。根据表4的极差分析可以发现，在实验所设计的三个因子中，C因子（维生素E的添加量）的极差值（12.7）最大，说明其对克氏原螯虾幼虾的成活率的影响最大，其次是B因子（维生素C添加量），而A因子（维生素A添加量）的极差值（4）最小，且小于空列的极差值（5.4），说明其对克氏原螯虾幼虾的成活率没有实质性的影响。由表4分析可以发现，因子水平组合为A3B1/B3C2时成活率最高，但由于A因子对克氏原螯虾幼虾的成活率没有实质性影响，B因子在水平1和3条件下的成活率相同，考虑到成本因素，A因子和B因子都可选水平1，即：要想获得最高成活率，可选A1B1C2作为最优组合方案，即A因子的水平1、B因子的水平1、C因子的水平2，也就是维生素A添加量为0.0048%、维生素C添加量为0.02%、维生素E添加量为0.04%。

克氏原螯虾幼虾增重率的极差分析结果见表4。由表4可知，C因子（维生素E的添加量）的极差最大，说明其对克氏原螯虾幼虾的增重率的影响最大，其次是A因子，而B因子的极差值（5.6）小于空列的极差值（11.8），说明其对克氏原螯虾幼虾增重率的影响没有重要影响。由表4分析可以发现，因子水平组合为A3B2C2时增重率最高。但由于B因子对克氏原螯虾增重率的影响没有达到显著水平，考虑到成本因素，B因子可选水平1，即可选择A3B1C2作为最优组合方案，即A因子的水平3，B因子的水平1，C因子的水平2，也就是维生素A添加量为0.0060%，维生素C添加量为0.02%，维生素E添加量为0.04%。

表4 维生素A、C、E的添加量对克氏原螯虾幼虾成活率及增重率影响的极差分析

2.2 维生素A、C、E的添加量对克氏原螯虾幼虾MDA含量、SOD活性和PO活性的影响

丙二醛（MDA）是脂质过氧化反应的最主要的产物之一，其在体内过多积累会对细胞产生毒害，因此其在体内含量越低，说明机体免疫力越高，清除这些毒害物质的能力越强。由表5可知，三个因子都对克氏原螯虾幼虾肝胰腺中MDA含量有实质性影响，其中B因子影响最大，A因子影响最小。由表5分析可以发现，因子水平组合为A2B1C1时（维生素A添加量为0.0054%，维生素C添加量为0.02%，维生素E添加量为0.02%），克氏原螯虾幼虾肝胰腺中MDA含量最低。

表5 维生素A、C、E的添加量对克氏原螯虾幼虾MDA含量、SOD活性、PO活性影响的极差分析

超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内重要的抗氧化酶，能够清除体内自由基，对抗与阻断氧自由基对细胞造成的损害。现有研究发现，在虾、蟹等甲壳动物中，饲料中添加适当的维生素提高了机体的抗氧化能力，使得机体内过氧化产物较少，而较低水平的过氧化产物（如MDA）不能刺激SOD活性，所以免疫力增高时会出现MDA含量和SOD活性都比较低的现象[7-8]。试验中不同维生素添加量组合下，克氏原螯虾幼虾肝胰腺中SOD活性也不同。克氏原螯虾幼虾肝胰腺中SOD活性的极差分析结果见表5。由表5可知，三个因子对克氏原螯虾幼虾肝胰腺中SOD活性影响大小的顺序为：B＞A＞C，其中只有B因子对克氏原螯虾幼虾肝胰腺中SOD活性有实质性影响，而A因子和C因子对克氏原螯虾幼虾肝胰腺中SOD活性的影响都不重要。由表5分析可以发现，因子水平组合为A2B1C1时，克氏原螯虾幼虾肝胰腺中SOD活性最低。但由于A因子对克氏原螯虾幼虾肝胰腺中SOD活性的影响不显著，考虑到成本因素，可以选A1B1C1作为最优组合方案，即维生素A添加量为0.0048%，维生素C添加量为0.02%，维生素E添加量为0.02%。

酚氧化酶（PO）是在氧分子存在下，能把酚类氧化成醌的酶，进而形成黑色素，在机体免疫过程中起重要作用。已有研究表明，克氏原螯虾肝胰腺中PO活性较低，而鳃组织中PO活性较强[9]，所以本实验测定了不同维生素添加量对克氏原螯虾幼虾鳃中PO活性的影响。由表5可知，三个因子对克氏原螯虾幼虾肝胰腺中PO活性影响大小的顺序为：C＞A＞B，其中只有C因子对克氏原螯虾幼虾鳃中PO活性有重要的影响，而A、B因子都没有实质性的影响。由表5分析可以发现，因子水平组合为A3B2C1时，克氏原螯虾幼虾鳃中PO活性最高。但由于A、B因子的影响都未达到显著水平，考虑成本因素，可以选择A1B1C1作为最优组合方案，即维生素A添加量为0.0048%，维生素C添加量为0.02%，维生素E添加量为0.02%。

2.3 维生素A、C、E的添加量对克氏原螯虾幼虾SOD和GPx基因表达的影响

SOD基因编码超氧化物歧化酶，如前所述这是清除自由基的主要酶，负责抵抗氧化胁迫。由表6可知，三个因子都对克氏原螯虾幼虾肝胰腺中SOD基因相对表达量有实质性影响，其中B因子影响最大，A因子影响最小。如上所述，甲壳动物的免疫力提高时，会出现MDA含量和SOD活性都很低的现象[7，18]。因此，我们选择最低的SOD基因表达水平作为最佳条件。由表6分析可以发现，因子水平组合为A2B1C1时，即维生素A添加量为0.0054%、维生素C添加量为0.02%、维生素E添加量为0.02%时，克氏原螯虾幼虾肝胰腺中SOD基因的表达水平最低。

GPx基因编码谷胱甘肽过氧化物酶（GPx），这是包括甲壳动物在内的许多生物抗氧化系统中的一个关键酶。本课题组前期的工作表明，GPx在克氏原螯虾的免疫过程中起重要作用[6]。因此，为探讨维生素添加量对克氏原螯虾幼虾的免疫力的影响，我们测定了各实验组克氏原螯虾幼虾肝胰腺中GPx基因的表达水平。由表6可知，三个因子都对克氏原螯虾幼虾肝胰腺中GPx基因相对表达量有实质性影响，其中C因子影响最大，B因子影响最小。由于GPx也参与抗氧化过程，而在甲壳动物中，当免疫力提高时，低水平的脂质过氧化产物（如MDA）不能刺激抗氧化剂的生产，因此我们认为幼虾的免疫力强时，GPx表达水平低。由表6分析可以发现，因子水平组合为A3B1C1时，即维生素A添加量为0.006%、维生素C添加量为0.02%、维生素E添加量为0.02%时，克氏原螯虾幼虾肝胰腺中GPx基因的表达水平最低。

表6 维生素A、C、E的添加量对克氏原螯虾幼虾SOD和GPx基因表达水平影响的极差分析

3 讨论

研究中发现，在所设计的三个因子中，维生素E添加量对克氏原螯虾幼虾的成活、生长和免疫的影响最大。在成活率和增重率这两个指标中，维生素E是最重要的影响因子。维生素E对MDA含量、PO活性以及SOD和GPx基因表达水平也有实质性的影响。这与其他水生经济动物的研究结果一致[10-11]。然而，我们的研究也显示，在饲料中添加过多的维生素E可能会对生长和免疫产生负面影响，维生素E添加水平较低（0.02%～0.04%）时，克氏原螯虾幼虾的成活率、增重率和免疫力较高。对其他水生动物的研究也发现了类似的现象。罗文等[12]的研究表明，过量的维生素E对红鳌螯虾Cherax quadricarinatus的繁殖会产生不利影响，合适的维生素E添加量为192 mg/kg，投喂这种饲料能够得到最大的产卵率、增重率、平均产卵数和孵化率[[13]。表明饲料中添加过多的维生素E对甲壳动物的免疫也有负面影响。

我们的研究还表明，维生素C在克氏原螯虾幼虾的成活和免疫中发挥了重要作用。特别说明的是，在该研究中使用的所有免疫相关指标中，除PO活性外，都与维生素C的添加量有实质性的关联，这进一步说明，维生素C在动物免疫过程中起重要作用。对罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）来说，与未添加维生素C的饲料组相比，投喂添加了维生素C的饲料组的虾增重率显著升高[14]。研究组前期对克氏原螯虾成体雌虾的研究发现，饲料中添加适量的维生素C使得虾体内的MDA含量大大减少，尤其在卵巢中更加明显[7]，这可能是维生素C能够促进繁殖的原因。然而本研究也显示，添加过量的维生素C对克氏原螯虾幼虾的存活、生长和免疫都产生了不利的影响，类似的结果在其他甲壳动物中也有报道[15-16]。研究表明，在维生素C添加量的3个水平中，水平1（0.02%）是克氏原螯虾幼虾成活和免疫的最佳条件。同时这一结果也表明，在免疫力最佳的条件下，成活率也最高。

在实验设计的三个因子中，维生素A添加量对克氏原螯虾幼虾的存活、生长和免疫的影响相对较小，但对增重率、MDA含量、以及SOD和GPx基因的表达水平有实质性的影响。当饲料中维生素A添加量为水平3（0.006%）时，增重率最大，GPx基因的表达水平最低，而饲料中维生素A添加量为水平2（0.0054%）时，MDA含量和SOD基因表达水平最低。这些结果表明，饲料中添加一定量的维生素A可以促进生长，降低MDA含量和SOD、GPx基因的表达水平，增强免疫力。需要注意的是，不同发育阶段的生物对维生素A的需求量不同，幼体阶段可能比成体阶段需要更多的维生素A，因此研究和配制饲料时需根据动物的发育阶段分别进行。

研究表明，饲料中添加适量的维生素（包括维生素A、维生素C、维生素E）能够促进克氏原螯虾幼虾的存活和生长，提高其免疫力。将克氏原螯虾幼虾的存活率和增重率作为主要考虑因素，综合考虑免疫指标及成本因素，我们建议在本次实验设计的条件中，选择A3B1C2作为三种维生素添加量的最佳组合，即维生素A添加量为0.006%，维生素C添加量为0.02%，维生素E添加量为0.04%。

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Effect of combined vitamin A，C and E supplementations in diet on survival，growth and immunity of juvenile Procambarus clarkii（Crustacea:Decapoda）cultured under laboratory conditions

Shao Guangming，Tan Hongyue，Wang Yufeng
（School of Life Sciences，Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology，Central China Normal University，Wuhan 430079，China）

Procambarus clarkii；vitamins；survival；growth；immunity

S963.73

A

1004-2091（2017）04-0046-07

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.04.010

2016-07-21）

武汉市学科带头人计划项目（201051730554）

邵光明（1988-），男，硕士研究生，研究方向为动物发育生物学.E-mail:931610671@qq.com

王玉凤，教授.E-mail:yfengw@mail.ccnu.edu.cn

Abstract:Vitamins are known to play essential roles in growth，immunity and reproduction of crustacean. The aim of this study was to determine the optimum dietary combinations of the supplementations of vitamin A（VA），vitamin C（VC）and vitamin E（VE）for survival，growth and immunity of juvenile crayfish Procambarus clarkii.In our orthogonal experiment，the three factors were varied at three levels（VAsupplementation: 0.0048，0.0054 and 0.006%;VCsupplementation:0.02，0.05 and 0.08%;VEsupplementation:0.02，0.04 and 0.06%）.Range analysis showed that the maximum survival rate of the juvenile crayfish occurred at VAsupplementation of 0.006%，VCsupplementation of 0.02 or 0.08%，VEsupplementation of 0.04%;maximum weight gain at VAsupplementation of 0.006%，VCsupplementation of 0.05%，VEsupplementation of 0.04%.The lowest malondialdehyde（MDA）content，specific activity of superoxide dismutase（SOD）and SOD gene expressionlevelwereobtainedatVAsupplementation0.0054%，VCsupplementationof0.02%，VE supplementation of 0.02%.The maximum phenol oxidase（PO）activity was obtained at VAsupplementation 0.006%，VCsupplementation of 0.05%，VEsupplementation of 0.02%.The lowest gene expression levels of GPx were obtained at VAsupplementation 0.006%，VCsupplementation of 0.02%，VEsupplementation of 0.02%. Taking survival and growth into key considerations，combining with immunity and cost as the secondary consideration，we suggest that a ratio of 0.006%of VA，0.02%of VCand 0.04%of VEsupplemented in the diet might be optimal for rearing the juvenile P.clarkii under the experimentally designed conditions studied.