固相支撑液液萃取/气相色谱-串联质谱法同时测定血液中双甲脒、杀虫脒及其代谢产物

高 雪，刘文文，王星敏

(1.重庆工商大学 天然药物研究重庆市重点实验室，重庆 400067；2.重庆工商大学 环境与资源学院，重庆 400067；3.重庆市公安局物证鉴定中心，重庆 400021)

固相支撑液液萃取/气相色谱-串联质谱法同时测定血液中双甲脒、杀虫脒及其代谢产物

高 雪1,2*，刘文文3，王星敏2

(1.重庆工商大学 天然药物研究重庆市重点实验室，重庆 400067；2.重庆工商大学 环境与资源学院，重庆 400067；3.重庆市公安局物证鉴定中心，重庆 400021)

建立了气相色谱-串联质谱法同时测定血液中双甲脒、杀虫脒及其代谢产物的分析方法。优化了样品前处理方法及气相色谱-串联质谱的分析条件，样品经固相支撑液液萃取柱(SLE)净化，乙腈-二氯甲烷(体积比1∶1)洗脱后，在多反应监测模式(MRM)下检测。结果表明，2,4-二甲基苯胺、4-氯邻甲苯胺和双甲脒在1.0～1 000 ng/mL范围内，其余目标物在2.0～1 000 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99；定量下限为1.0～2.0 ng/mL，加标回收率为88.6%～113%。该方法简便、快捷、样品用量小，结果准确可靠，灵敏度高，适用于血液中6种目标物的同时检测。

气相色谱-串联质谱法；固相支撑液液萃取；血液；杀虫脒；双甲脒；代谢产物

图1 6种目标物的分子结构图Fig.1 Molecular structures of six compounds

三元取代的甲脒类化合物具有潜在的杀螨和杀菌活性，以其为基础开发出的杀虫脒(Chlordimeform)和双甲脒(Amitraz)农药[1](结构式见图1)被广泛应用于农业生产。双甲脒和杀虫脒被人体吸收后，代谢速度快，在体内分别被代谢为单甲脒(N-2,4-Dimethylphenyl-N-methyl-formamidine,DMPF)、2,4-二甲基苯基甲酰胺(2,4-Dimethylformamidine,DMF)、2,4-二甲基苯胺(2,4-Dimethylaniline,DMA)和4-氯邻甲苯胺(4-Chloro-2-methylaniline)(结构式见图1)，母体及代谢产物均对人体具有危害性[2-3]，因其滥用或使用不当而导致的人体中毒事件多有发生[4-5]。因此，在生物检材中，对双甲脒和杀虫脒原药及其代谢物同时进行检测很有必要。血液作为易得的生物检材，常见于中毒案件中的检测分析，因此建立血液基质中双甲脒、杀虫脒杀虫剂及其代谢产物的快速、灵敏、准确的检测方法十分必要。

目前针对甲脒类农药及其代谢产物的检测方法研究主要针对蜂蜜和鱼类等农副产品，常见检测方法为气相色谱法[6-7]、气相色谱-质谱法[8-11]和液相色谱-质谱法[12-13]。而针对中毒血液检材中甲脒类农药及其代谢产物的检测方法研究较少。

固相支撑液液萃取法(SLE)作为一种较新的前处理方法，在传统液液提取方法的基础上，采用硅藻土作为吸附剂，利用其吸水性强、具有惰性等特点，快速地吸附样品基质中的水分使目标物与水分分离，具有不易产生乳化现象、基质效应降低和需要样品量少等优点。相较于固相微萃取法(SPME)[14]、液液萃取法(LLE)[15-16]、固相萃取法(SPE)[17-18]等传统血液前处理方法，有效提高了样品的提取能力和效率，近年来被广泛应用于血液和尿液的前处理[19]。此外，相比于气相色谱-质谱法的全扫描方式，气相色谱-串联质谱法的抗噪音和干扰能力更强，对目标物具有更高的选择性和灵敏度，更适合于多组分、低含量水平生物基质中农药的检测。

本研究利用固相支撑液液萃取(SLE)法,建立了适合血液基质中常见甲脒类农药及其代谢产物的前处理方法,然后使用GC-MS/MS 对其进行定性定量分析,从而为血液中常见的甲脒类农药及其代谢产物检测提供了科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津TQ-8040型气相色谱-串联质谱仪：日本岛津公司产品；Allegra X-64R型高速冷冻离心机：贝克曼公司产品；HGC-24型氮吹仪:天津恒奥公司产品；Millipore Direct-Q3型纯水仪:美国Millipore公司产品；SLE固相支撑液液萃取小柱:天津博纳艾杰尔科技有限公司产品。

甲醇、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、甲基叔丁基醚(色谱纯，美国Tieda公司)；pH值分别为4.0，6.0，8.0，10.0和12.0的缓冲溶液(Fluka 公司)；双甲脒、单甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺、2,4-甲基苯胺、杀虫脒、4-氯-2-甲基苯胺(北京百灵威公司)；空白血液从重庆市血液中心获取。

1.2 实验条件

1.2.1 色谱条件 色谱柱：岛津SH-Rxi-5 Sil MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管色谱柱；升温程序：50 ℃保留1 min，以25 ℃/min升温至125 ℃/min，然后以10 ℃/min升温至300 ℃/min；载气(He)流速1.5 mL/min，进样量1.0 μL；碰撞气：Ar(99.999%)；不分流进样；进样口温度：250 ℃。

1.2.2 质谱条件 电子轰击(EI)离子源；电子能量：70 eV；离子源温度：200 ℃；色谱质谱接口温度；280 ℃；溶剂延迟时间：2 min；多反应监测模式(MRM)进行检测；其它质谱参数见表1。

表1 6种目标物的保留时间及多反应监测模式质谱参数Table 1 Retention times(Rt) and MRM parameters of six compounds

* quantitative ion

1.3 样品处理

准确移取待测血液100 μL，加入pH 8.0的缓冲溶液400 μL，涡旋混匀后将样品加入固相支撑液液萃取柱中，待样品全部均匀吸附在填料上后，平衡5 min。每次使用1.5 mL的乙腈-二氯甲烷混合洗脱溶剂(体积比1∶1)进行洗脱，连续洗脱3次。合并收集到的洗脱液在40 ℃加热下用氮气吹干后，用甲醇复溶后定容至50 μL，进气质联用色谱仪检测。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件优化

2.1.1 洗脱溶剂的优化 为了有效地将所有目标物从SLE柱上洗脱下来，将标准工作液添加到空白血液中配成浓度为200.0 ng/mL的标准添加样品。选取甲醇、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷5种液液提取和固相萃取常用的溶剂作为洗脱溶剂进行洗脱实验，洗脱次数和洗脱体积按照文献操作[20]。结果表明，乙腈作为洗脱溶剂时对2,4-二甲基苯胺、单甲脒、双甲脒和4-氯-2-甲基苯胺的洗脱效率大于80%，二氯甲烷对2,4-二甲基苯基甲酰胺、双甲脒和杀虫脒的洗脱效率大于80%，为使所有目标物都能被有效洗脱，进一步考察了乙腈-二氯甲烷溶剂的洗脱能力。结果表明当洗脱溶剂乙腈-二氯甲烷的配比为1∶1时对所有目标物的回收率均大于80%，因此最终选择其作为洗脱溶剂。

图2 不同pH值对目标物回收率的影响(n=3)Fig.2 Effect of different pH values on recoveries of target compounds(n=3)

2.1.2 样品溶液pH值对回收率的影响 已有文献报道表明，双甲脒及杀虫脒使用液液提取法在碱性条件下的回收率较高[21]。本实验考察了浓度为500.0 ng/mL标准溶液加标样品在不同 pH值(pH 4.0,6.0，8.0，10.0，12.0)下的回收率，结果见图2。结果表明，在pH 8.0条件下所有目标物的回收率均大于80%，因此本实验选取pH 8.0为最佳提取pH值。

2.2 气相色谱-串联质谱条件的优化

本方法采用多反应监测(MRM)模式进行分析，应用特征离子对进行目标物的定性定量检测。为了获取不同目标物稳定可靠的质谱条件，保证定性定量分析的准确性，分别对每种目标物离子对的母离子、子离子和碰撞能等一系列参数进行优化。优化后的每种目标物特征离子对MRM色谱图见图3，质谱参数见表1。

图3 6种目标物的定量离子MRM图谱(500 ng/mL)Fig.3 MRM chromatograms of six targeted compounds(500 ng/mL)

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系与方法检出限 使用不含目标物的空白血液为基质，添加不同浓度的混合标准工作液配成系列含有6种目标物的基质添加样品，采用“1.2”条件进行气相色谱-串联质谱进行分析，以各目标物的质量浓度(x，ng/mL)为横坐标,定量离子对的色谱峰面积(y)为纵坐标绘制标准校正曲线，结果见表2。结果显示，6种目标物在测试范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99。

在空白血液中，添加一定量的混合标准溶液，按照建立好的处理方法和仪器检测条件对其进行检测，以每种目标物定量离子对色谱峰的信噪比≥10时来确定目标物的定量下限(LOQ)。结果表明，6种目标物的LOQ为1.0～2.0 ng/mL(表2)。

表2 6种目标物的定量下限、线性方程、相关系数、回收率与精确度(n=6)Table 3 The quantitation limits ,linear equations,correlation coefficients(r2),recoveries and RSDs of six compounds(n=6)

2.3.2 准确度与精密度 取不含6种目标物的空白血液为基质，添加不同浓度的标准工作液后分别配成浓度为LOQ，50.0 ng/mL，500 ng/mL的标准添加样品，每个浓度配制6个样品，按本文优化的前处理和检测方法进行检测，并测定每种目标物的含量，计算回收率与相对标准偏差，结果见表2。测得回收率为88.6%～113%，相对标准偏差均不大于11.6 %，方法的准确度和精密度符合实验要求。

2.4 实际样品的检测

2015年3月，某女，27 岁，被疑为杀虫脒农药中毒经抢救无效死亡，于死后采集心血按照本方法进行样品前处理并检测。结果检测出杀虫脒浓度为187.5 ng/mL，4-氯邻甲苯胺浓度为278.3 ng/mL，样品色谱图见图4。2015年6月，在某废弃房屋中发现1具未知名尸体，现场发现疑似农药瓶，提取现场农药瓶和心血按照本文方法进行样品前处理并检测。结果农药瓶中检出双甲脒和单甲脒成分，心血中检出双甲脒浓度为89.5 ng/mL，单甲脒浓度为21.5 ng/mL，DMF浓度为70.6 ng/mL，DMA浓度为154.3 ng/mL。

3 结 论

本文采用SLE/GC-MS/MS检测方法，建立了血液中双甲脒、杀虫脒及其代谢产物的测定方法。血液样品中目标物经SLE方法净化富集后，进行GC-MS/MS测定。本方法可同时定性定量分析血液中6种目标物，回收率高、 检出限低、精密度好，能够满足日常中毒案件中对于双甲脒、杀虫脒及其代谢产物的检验需求。

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Determination of Amitraz,Chlordimeform and Their Metabolites in Blood by Solid Supported Liquid Extraction and Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

GAO Xue1,2*,LIU Wen-wen3,WANG Xing-min2

(1.Chongqing Key Laboratory of Natural Medicine Research,Chongqing Technology and Business University,Chongqing 400067,China；2.College of Environment and Resources,Chongqing Technology and Business University,Chongqing 400067,China；3.Chongqing Institute of Forensic Science,Chongqing 400021,China)

A method was developed for the determination of amitraz,chlordimeform and their metabolites in blood by gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS).The conditions for sample pretreatment and GC-MS/MS parameters were optimized.The samples were pretreated by solid supported liquid extraction(SLE),and eluted with acetonitrile-dichloromethane(1∶1).The detection was carried out by GC-MS/MS in multiple reaction monitoring(MRM) mode.Good linear relationships for 2,4-dimethylaniline(DMA),4-chloro-2-methylaniline and amitraz were obtained in the range of 1.0-1 000 ng/mL,and those for other three compounds were obtained in the range of 2.0-1 000 ng/mL,with correlation coefficients more than 0.99.The limits of quantitation were in the range of 1.0-2.0 ng/mL,and the recoveries ranged from 88.6% to 113%.With the advantages of simplicity,rapidness,low sample consumption,accuracy and reliability,this methed is suitable for the determination of six compounds in blood.

gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS)；solid supported liquid extraction；blood；chlordimeform；amitraz；metabolites

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.04.017

2016-09-18；

2016-11-24

O657.63；F767.2

A

1004-4957(2017)04-0539-05

*通讯作者：高 雪，副研究员，研究方向：天然产物化学,E-mail:gaoxue@ctbu.edu.cn