响应曲面法优化花生壳中木犀草素的微波提取工艺

崔建强，唐 静，王 燕，张 爽

(陕西国际商贸学院医药学院，陕西 咸阳 710246)



响应曲面法优化花生壳中木犀草素的微波提取工艺

崔建强，唐 静，王 燕，张 爽

(陕西国际商贸学院医药学院，陕西 咸阳 710246)

以木犀草素得率为评价指标，采用单因素实验和响应曲面法优化花生壳中木犀草素微波提取工艺。确定最优提取工艺为：乙醇体积分数80%、微波提取时间70 s、料液比1∶20(g∶mL)、微波功率1 000 W，在此条件下，木犀草素得率可达到0.713%。该方法设计合理，可用于花生壳中木犀草素的提取。

木犀草素；响应曲面法；微波提取

花生(Arachis hypogaea)，一年生草本植物，在我国已有500多年种植历史，多个省份均有种植，产量和种植面积位居世界前列[1]。花生壳含有黄酮类物质木犀草素[2]，木犀草素具有抑菌、抗炎、抗氧化等[3]多种生理功能。近年来，微波提取技术因提取效率高、能耗低、提取时间短等优点[4]被广泛应用于天然产物有效物质的提取。响应曲面法是目前较为先进的提取工艺优化方法[5-6]。目前，对花生壳中木犀草素的提取工艺优化大多采用正交实验法，尚未见到响应曲面法优化花生壳中木犀草素微波提取工艺的报道。鉴于此，作者在单因素实验的基础上，以木犀草素得率为评价指标，用响应曲面法优化花生壳中木犀草素微波提取工艺，拟为进一步开发利用花生壳资源提供参考。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

花生壳，市售。

无水乙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；石油醚(沸程60～90 ℃)，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；木犀草素标准品(纯度≥98%)，上海友思生物技术公司。

WF-4000型微波快速反应系统，上海屹尧仪器科技发展有限公司；FA1104型电子分析天平、FW-100D型高速万能粉碎机，天津鑫博得仪器有限公司；KQ2200DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 花生壳前处理

取新鲜的花生壳，清洗，干燥，用高速万能粉碎机粉碎成一定粒径的粗粉，用石油醚超声脱脂2次(每次20min，温度40 ℃，功率200W)，得到花生壳干粉。

1.3 花生壳中木犀草素的提取

按照一定料液比(花生壳干粉与乙醇的比例)称取一定质量的花生壳干粉加到100 mL一定体积分数的乙醇中，摇匀，静置2 h；在微波快速反应系统中于一定功率、70 ℃下提取一定时间；待溶液温度降至室温后抽滤，收集滤液，滤渣再在相同条件下提取1次；合并滤液，加热干燥使其挥醇并浓缩成浸膏，用石油醚对浸膏进行超声脱脂处理，干燥使石油醚挥干，用醇溶水沉法纯化，浓缩，干燥，得木犀草素粉末。

1.4 木犀草素得率的测定

1.4.1 标准品溶液的制备

精密称取2.0 mg干燥至恒重的木犀草素标准品，置于100 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀后备用。

1.4.2 检测波长的确定

取木犀草素标准品溶液，在200～600 nm之间进行全波长扫描。结果发现，木犀草素在351 nm处出现最大吸收。因此，以351 nm作为检测波长。

1.4.3 标准曲线的绘制

分别精密量取木犀草素标准品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀。用紫外分光光度计测定351 nm处吸光度，以吸光度(y)为纵坐标、木犀草素浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，拟合得线性回归方程。

1.4.4 木犀草素得率的计算

精密称取一定量的木犀草素粉末，加入一定量的无水乙醇超声溶解，配成不同浓度的待测溶液，测定其吸光度(每种浓度测定3次)，根据拟合的线性回归方程计算木犀草素含量，按下式计算木犀草素得率。

式中：m0为木犀草素含量，mg；V为样液总体积，mL；V0为测定所用样液的体积，mL；m为花生壳干粉质量，g。

1.5 提取工艺优化

1.5.1 单因素实验

在乙醇用量为100 mL、提取温度为70 ℃的条件下，分别考察乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%、90%)、微波功率(300 W、450 W、600 W、750 W、900 W)、微波提取时间(40 s、50 s、60 s、70 s、80 s)、料液比(1.5∶100、2.5∶100、5.0∶100、7.5∶100、10.0∶100，g∶mL)对木犀草素得率的影响。

1.5.2 响应曲面法实验

根据单因素实验结果，找出对木犀草素得率影响最大的3个因素，采用Box-Behnken实验设计3个水平进行响应曲面法实验，根据响应曲面构建的三维图确定最优的微波提取工艺。

2 结果与讨论

2.1 木犀草素的标准曲线(图1)

图1 木犀草素的标准曲线Fig.1 The standard curve of mignonette

由图1可知，木犀草素在0.002～0.010 mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 乙醇体积分数对木犀草素得率的影响

在提取温度为70 ℃、微波功率为1 000 W、料液比为1∶20(5.0 g花生壳干粉∶100 mL乙醇，乙醇体积分数为50%～90%，下同)、微波提取时间为70 s的条件下，考察乙醇体积分数对木犀草素得率的影响，结果见图2。

图2 乙醇体积分数对木犀草素得率的影响Fig.2 Effect of volume fraction of ethanol on mignonette yield

由图2可以看出，随着乙醇体积分数的增大，木犀草素得率先升高后降低，在乙醇体积分数约为80%时得率较高。实验发现，乙醇体积分数为50%～70%时，水含量较高，易溶于水的糖类、蛋白质易溶出，导致提取液腐败变质，得率较低；当乙醇体积分数超过80%后，水含量过低不利于微波发挥作用，提取液颜色变浅，得率降低，同时，脂溶性成分溶出率提高也给后续的精制带来较大的困难。综合考虑，选择乙醇体积分数为80%较为适宜。

2.2.2 微波功率对木犀草素得率的影响

称取5.0 g花生壳干粉，按1∶20的料液比加入80%乙醇100 mL，在提取温度为70 ℃、不同微波功率下提取70 s，考察微波功率对木犀草素得率的影响，结果见图3。

图3 微波功率对木犀草素得率的影响Fig.3 Effect of microwave power on mignonette yield

由图3可以看出，随着微波功率的增大，木犀草素得率不断升高，在600 W以后上升趋势较缓。可能是因为，在微波辐射的过程中，溶质吸收微波的能力逐渐趋于饱和，故微波功率增大到一定程度时，对木犀草素的溶出影响不大。因此，微波功率不是影响木犀草素得率的关键因素。由于本实验所用微波仪的最大功率为1 000 W，因此后续实验微波功率均为1 000 W。

2.2.3 微波提取时间对木犀草素得率的影响

称取5.0 g花生壳干粉，按1∶20的料液比加入80%乙醇100 mL，在提取温度为70 ℃、微波功率为1 000 W下分别提取不同时间，考察微波提取时间对木犀草素得率的影响，结果见图4。

由图4可以看出，随着微波提取时间的延长，木犀草素得率先升高后降低，在微波提取时间为70 s时，得率达到最高。这可能是由于，长时间的微波辐射使木犀草素有所变性，或者是产生的热效应时间较长，使溶剂有所挥发，减少了木犀草素的溶出。因此，选择微波提取时间为70 s较为适宜。

2.2.4 料液比对木犀草素得率的影响

分别称取花生壳干粉1.5 g、2.5 g、5.0 g、7.5 g、10.0 g，加入80%乙醇100 mL，在提取温度为70 ℃、微波功率为1 000 W、微波提取时间为70 s的条件下，考察料液比对木犀草素得率的影响，结果见图5。

图4 微波提取时间对木犀草素得率的影响Fig.4 Effect of microwave extraction time on mignonette yield

图5 料液比对木犀草素得率的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on mignonette yield

由图5可以看出，随着料液比的增大，木犀草素得率先骤降再缓缓下降。表明在溶剂用量一定时，加入的花生壳干粉越少，木犀草素得率越高。这是因为，浓度差较大利于有效物质的溶出。但是，在实际应用中，溶剂用量过大，回收时耗时耗能，增加回收成本。综合考虑，选择料液比为5.0∶100(即1∶20)较为适宜。

2.3 响应曲面法实验结果

2.3.1 实验设计

根据单因素实验结果，选取乙醇体积分数、微波提取时间、料液比作为自变量，以木犀草素得率为因变量(即响应值)，通过Box-Behnken实验设计[7]，构建三维数学模型来优化木犀草素的微波提取工艺。实验设计的因素与水平见表1，响应曲面法实验结果见表2。

2.3.2 数学模型的建立及显著性的检验结果

对表2数据进行二次多项式的回归方程拟合，得到回归方程模型为：Y=-4.47383+0.10651A+0.029868B+0.015158C+5.28375AB+8.84852AC-17.4716BC-19.80843A2-6.11295B2-17.95291C2(R2=0.9697，P<0.0001)。采用响应面的ANOVA进行回归参数分析，检验回归方程模型和各项参数的显著性，结果如表3所示。

表1 Box-Behnken实验设计的因素与水平

Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken design

表2 响应曲面法实验结果

Tab.2 Results of response surface methodology

表3 响应面回归方程模型的方差分析

Tab.3 Variance analysis of regression requation model for response surface

2.3.3 交互作用的分析和优化

用Design-Expert 8.0.6软件得出乙醇体积分数、微波提取时间和料液比3个实验参数两两交互作用对得率影响的趋势图如图6所示。

由图6a可以看出，微波提取时间的响应面曲线变化幅度小且较平缓，对得率影响不明显；乙醇体积分数的响应面曲线振幅较大，对得率的影响较显著；二者等高线趋于圆形，说明二者交互作用对木犀草素得率无显著影响。由图6b可以看出，料液比和乙醇体积分数响应面曲线振幅都较大，对得率的影响较显著，料液比在(2.50～5.00)∶100范围时得率较高；二者等高线呈椭圆形，说明二者交互作用对得率的影响较明显。由图6c可以看出，料液比的响应面曲线较陡，微波提取时间的响应面曲线较平缓，说明料液比对得率影响较显著；二者等高线呈圆形，说明二者交互作用对得率影响不明显。等高线图和响应面图分析结果与方差分析结果基本一致。

2.3.4 回归模型验证

从图6可以看出有最大的响应值，通过软件分析预测最佳提取工艺为：乙醇体积分数80%、微波提取时间70 s、料液比5.0∶100(即1∶20)。为了检验该回归模型是否准确，分别在预测的最优提取工艺条件下进行5次验证实验，木犀草素得率平均值为0.713%。表明该模型设计合理。

图6 等高线图和响应面图Fig.6 The contour map and the response surface map

3 结论

通过单因素实验和响应曲面法确定花生壳中木犀草素的最优微波提取工艺为：乙醇体积分数80%、微波提取时间70 s、料液比1∶20(g∶mL)、微波功率1 000 W，在此条件下，木犀草素得率为0.713%。

[1] 张艳.花生壳中木犀草素的分离纯化及其化学合成[D].西安：西安理工大学,2010.

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Optimization on Microwave Extraction Process of Mignonette from Peanut Shells by Response Surface Methodology

CUI Jian-qiang,TANG Jing,WANG Yan,ZHANG Shuang

(SchoolofMedicine,ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce,Xianyang710246,China)

Usingmignonetteyieldasanevaluationindex,themicrowaveextractionprocessofmignonettefrompeanutshellswasoptimizedbyasinglefactorexperimentandresponsesurfacemethodology.Theoptimumextractionconditionswereasfollows:ethanolvolumefractionof80%,microwaveextractiontimeof70s,solid-liquidratioof1∶20(g∶mL),andmicrowavepowerof1 000W.Underaboveconditions,mignonetteyieldreached0.713%.Thismethodisfeasible,andcanbeusedtoextractmignonettefrompeanutshells.

mignonette;responsesurfacemethodology;microwaveextraction

陕西省教育厅专项科研计划项目(16JK2036)，2016年陕西国际商贸学院科研项目(SMXY201605)

2016-12-06

崔建强(1979-)，男，陕西西安人，讲师，研究方向：药物分析化学，E-mail:1030287236@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.04.010

R284.2

A

1672-5425(2017)04-0042-05

崔建强，唐静，王燕，等.响应曲面法优化花生壳中木犀草素的微波提取工艺[J].化学与生物工程，2017，34(4)：42-46.