响应面法优化解淀粉芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件

许曌昕，曾辉，曾德勇，3，曹文涛*，王芙蓉，席德州

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州盛世甲秀酒业有限公司，贵州贵阳550004；3.贵州茅台（集团）生态农业产业发展有限公司，贵州黔东南557500）

响应面法优化解淀粉芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件

许曌昕1，曾辉2，曾德勇1，3，曹文涛1*，王芙蓉1，席德州1

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州盛世甲秀酒业有限公司，贵州贵阳550004；3.贵州茅台（集团）生态农业产业发展有限公司，贵州黔东南557500）

在单因素试验的基础上，应用响应面法对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）GZUB-7产中性蛋白酶的发酵条件进行优化，以达到提高菌株产中性蛋白酶酶活力的目的。结果表明，发酵培养基的最佳组分为葡萄糖用量50 g/L、豆粕粉40 g/L、CaCl2添加量0.44 g/L；最适发酵条件为发酵温度40℃、初始pH 7.0、接种量6.0%、发酵时间40 h，在此条件下，该菌株产中性蛋白酶酶活力达到192.7 U/mL。

解淀粉芽孢杆菌；中性蛋白酶；响应面法；条件优化

蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，也是重要的工业用酶，广泛应用于洗涤剂、皮革、毛皮、酿酒、酱油以及纺织、医药品、化妆品等的生产和生物材料的提取[1-2]。应用最多的微生物蛋白酶主要由芽孢杆菌属和曲霉菌属产生，细菌的中、碱性蛋白酶通常是用液体深层培养法生产，而霉菌蛋白酶则更适于采用固体培养法生产，固体培养不易污染、容易管理、节省能源、单位容器产量高。国内外对真菌、芽孢杆菌生产蛋白酶做了大量的研究，对产酶培养液及培养条件都有较多的探讨[3-7]，然而，利用解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）生产中性蛋白酶的研究则很少[8-9]。

解淀粉芽孢杆菌是一种好氧产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，具有广谱抗菌活性和较强的抗逆能力，在自然界分布广泛，对人畜无毒无害，不污染环境，且其代谢产物较为丰富[10]。传统发酵制品及其环境中有着丰富的微生物资源，这些微生物在长期的生产过程中缓慢驯化，使其表现出各种稳定的优良特性[11]。本试验以从茅台高温大曲中筛选出的高产中性蛋白酶解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）GZUB-7作为研究对象，该菌生长迅速，在脱脂牛奶平板上水解圈与菌落直径比高达6.64，产中性蛋白酶活力明显高于其他细菌，参考芽孢杆菌产蛋白酶优化方法[12-13]，采用响应面法对该菌产酶的发酵液组成成分及培养条件进行了优化，以期为扩大微生物菌种资源的开发和提高解淀粉芽孢杆菌产中性蛋白酶的实际生产应用提供一定的理论指导和实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种与培养基

解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）GZUB-7：从茅台高温大曲中筛选出的一株高产中性蛋白酶的菌株。由本实验室保藏。

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，琼脂15 g/L，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min。

牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5 g/L，pH 7.0～7.2，分装锥形瓶，121℃灭菌20 min。

发酵培养基[6]：葡萄糖60 g/L，豆粕粉60 g/L，CaCl20.5 g/L，Na2HPO4·12H2O 4 g/L，pH 8.0，121℃灭菌20 min。

1.1.2 试剂

CaCl2、MgCl2、NaCl、FeSO4、Na2HPO4·12H2O、硫酸铵（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；HCl（分析纯）：重庆川东化工（集团）有限公司；葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉（均为分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；蛋白胨、琼脂粉（生化试剂）：青岛高科园海博生物技术有限公司；福林酚（分析纯）：北京索莱宝科技公司；豆粕粉及麸皮：贵阳市油榨街农贸市场。

1.2 仪器与设备

ME204TE电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；THZ-98C型恒温振荡培养箱：上海一恒科技有限公司；pHS-3G型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；TGL-16G型台式高速离心机：上海菲恰尔分析仪器有限公司；LDZX-40B型立式蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械有限公司；SW-CJ-1FD型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；722N型分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；HH-6型恒温水浴锅：常州澳华仪器有限公司；QYC-2112/ KYC-1112恒温培养摇床：上海福玛实验设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的培养条件及发酵

将解淀粉芽孢杆菌GZUB-7从斜面转接于牛肉膏蛋白胨平板上活化，35℃恒温培养24h。取装液量为50mL/250mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基，接种活化的菌种，于35℃、180 r/min振荡培养12 h后作为种子液。将种子液转接到初始发酵培养基中，进行发酵培养。

1.3.2 中性蛋白酶活力的测定

将10 mL发酵液在4℃条件下4 000 r/min离心15 min，取上清液5 mL，以磷酸缓冲液（pH7.2）稀释至25 mL，用福林酚法测定发酵液中的中性蛋白酶酶活力[14]。酶活力单位定义：在pH 7.2、40℃条件下，每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活性单位（U/mL）。

1.3.3 发酵培养基组分及发酵条件单因素优化

在初始发酵培养基和发酵条件的基础上，分别考察培养基不同碳源（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉）、氮源（麸皮、蛋白胨、豆粕粉、硫酸铵）、无机盐（CaCl2、MgCl2、NaCl、FeSO4）、初始pH（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、接种量（3%、4%、5%、6%、7%）、发酵温度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）、发酵时间（0、8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h）对中性蛋白酶酶活力的影响，最终确定发酵培养基组分及发酵条件。

1.3.4 响应面优化试验

在单因素试验结果基础上，采用3因素3水平的Box-Behnken响应面试验设计法[15]，以碳氮比（C/N）、CaCl2用量和接种量为自变量，以中性蛋白酶的酶活为指标进行优化。采用Design-Expert 8.0软件对试验数据进行分析。响应面试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同碳源、氮源对解淀粉芽孢杆菌GZUB-7发酵产酶

活力的影响

在初始发酵培养基的基础上，分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉作为发酵培养基的碳源，以麸皮、蛋白胨、豆粕粉、硫酸铵作为培养基的氮源，考察不同碳源、氮源对中性蛋白酶酶活力的影响，结果如图1所示。

图1 不同碳源、氮源对中性蛋白酶酶活力的影响Fig.1 Effect of different carbon sources and nitrogen sources on neutral protease activity

由图1可知，以葡萄糖作为碳源时，解淀粉芽孢杆菌GZUB-7产中性蛋白酶酶活力最高，为95.6 U/mL，而以麦芽糖作为碳源次之，二者明显高于蔗糖、淀粉作为碳源时的酶活力，因而选择可以直接利用的葡萄糖作为碳源；微生物能够利用的氮源分有机氮源和无机氮源两种，选用蛋白胨作为氮源时酶活最高，豆粕粉稍次之，而用无机氮源硫酸铵时酶活很低，说明硫酸铵不利于该菌株产酶，考虑成本原因，选用来源广、成本低的豆粕粉作为氮源。

2.1.2 葡萄糖和豆粕粉用量对中性蛋白酶酶活力的影响

在基础发酵培养基中，以葡萄糖作为碳源，豆粕粉作为氮源，用量分别为20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70g/L，对中性蛋白酶活力的影响结果如图2所示。由图2（A）可知，当葡萄糖用量为20～50 g/L时，中性蛋白酶活力逐渐上升；当葡萄糖用量为50 g/L时，产生的酶活力最高为111.4 U/mL；之后随着葡萄糖用量的增多，酶活力有所下降，故确定葡萄糖用量为50 g/L。

氮源在代谢过程中被降解为氨基酸等含氮化合物，除供自身生长需要外，还参与酶的合成，因此氮源用量对于产酶有重要作用。由图2（B）可知，当豆粕粉用量为20～40 g/L时，中性蛋白酶活力呈上升趋势；当豆粕粉用量增加至70 g/L时，蛋白酶活力反而下降，说明过量的氮源并不能增加酶的产量，反而会抑制酶的活力，因此选择豆粕粉用量为40 g/L。

图2 葡萄糖(A)和豆粕粉(B)的用量对酶活力的影响Fig.2 Effect of glucose(A)and soybean cake powder(B) addition on neutral protease activity

微生物的生长和代谢离不开碳和氮这两种重要的营养元素，两者在量上的比例关系为碳氮比（C/N）。C/N作为影响因子，参与细菌的产能代谢过程，主要作用于微生物的自身合成代谢过程和有机物在微生物体内的生物氧化过程。因此，对菌株生长与产物的代谢的影响来讲，C/N的影响更加重要。在单因素试验中，最终确定的最佳碳源为葡萄糖，用量为50 g/L，最佳氮源为豆粕粉用量为40 g/L，理论碳氮比为1.25。为了研究最佳的影响因素，选择C/N为1.00、1.25、1.50进行响应面试验。

2.1.3 不同无机盐及用量对中性蛋白酶酶活力的影响

分别添加CaCl2、MgCl2、NaCl、FeSO4作为无机盐，用量为0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L、0.7 g/L、0.8 g/L，测定发酵液中中性蛋白酶活力，结果如图3所示。由图3可知，CaCl2对解淀粉芽孢杆菌GZUB-7发酵产中性蛋白酶活力有显著影响，当CaCl2用量为0.4 g/L时，中性蛋白酶活达到最大147.1 U/mL。随着MgCl2用量的增加，中性蛋白酶活力呈下降趋势，微量的Mg2+会抑制蛋白酶的产量；随NaCl用量的增加，菌株GZUB-7产中性蛋白酶活力先增加后减小，但是始终低于CaCl2为无机盐时中性蛋白酶活力；而FeSO4对菌株GZUB-7产中性蛋白酶活力影响较小，且中性蛋白酶活力较低。因此选择用量0.4 g/L CaCl2为发酵培养基中的无机盐。

图3 不同金属盐对酶活的影响Fig.3 Effect of different metal salts on neutral protease activity

2.1.4 初始pH值对中性蛋白酶酶活力的影响

考察发酵液初始pH值对发酵液中性蛋白酶活力的影响，结果如图4所示。由图4可知，随初始pH值的增加，中性蛋白酶活力呈先增加后降低的趋势，中性条件下有利于其产酶，当初始pH值为7.0时，菌株GZUB-7产中性蛋白酶活力最大，为166.3 U/mL；发酵液初始pH值为7.0时产酶效果相对较佳，但差异不是特别明显，因此，选择发酵液初始pH 7.0为宜。

图4 初始pH值对中性蛋白酶酶活力的影响Fig.4 Effect of initial pH on neutral protease activity

2.1.5 接种量对中性蛋白酶酶活力的影响

考察不同的接种量对中性蛋白酶酶活力的影响，结果如图5所示。由图5可知，当接种量为6%时，中性蛋白酶酶活力高达186.3 U/mL，相比3%时的酶活增加80%，但接种量为7%时，酶活力反而下降。这可能与底物竞争相关，因此，选择接种量6%为宜。

图5 接种量对中性蛋白酶酶活力的影响Fig.5 Effect of inoculum on neutral protease activity

2.1.6 发酵温度对中性蛋白酶酶活力的影响

该解淀粉芽孢杆菌GZUB-7从茅台高温大曲中筛选得到，能够耐受较高的温度。由图6可知，发酵温度对产酶酶活影响不大，在40℃时所产酶活较高，因此选择40℃条件下进行发酵。

图6 发酵温度对中性蛋白酶酶活力的影响Fig.6 Effect of fermentation temperature on neutral protease activity

2.1.7 发酵时间对中性蛋白酶活力的影响

图7 不同发酵时间下菌体生长与蛋白酶活力的关系Fig.7 Relationship between cell growth and protease activity in different fermentation time

由图7可知，该菌株接入种子液后16 h就可以进入稳定期，稳定期可以持续8 h以上。观察酶活力曲线，对数生长期就有蛋白酶产生，表明中性蛋白酶与细胞生长在对数生长期同步进行，而进入生长稳定期后开始大量分泌蛋白酶，40 h酶活达到最大值178.6 U/mL，随着菌体的溶解，酶活力下降，可能是由于次级代谢产物的积累，使得蛋白酶活力得到抑制。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验设计与结果

根据单因素试验的结果，以C/N、CaCl2添加量和接种量3个因素为变量，中性蛋白酶酶活力为响应值（Y），进行响应面试验优化，试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.2.2 构建数学模型及模型检验

采用Design-Expert 8.0软件对试验数据进行分析，构建数学模型。通过对该模型进行方差分析，最终得到二次回归方程为：

对该模型进行显著性检验，可得回归模型方差分析见表3，由表3可知，拟合方程失拟项的值为27.09，P＞F值为0.035 8＜0.05，失拟项检验显著，表明该方程的拟合效果较差。在原有的基础上，尝试逐一去掉一个交互项，以减小失拟项LackofFit值，提高方程的拟合效果。初步分析发现，当只去掉X1X2交互项时，方程失拟项值变为20.71，P＞F值为0.046 6，失拟项检验显著，表明当前方程的拟合效果还是较差；由表3可知，去掉X1X2、X2X3交互项后，模型P＜0.000 1，回归模型显著，失拟项值变为17.01，且失拟项P= 0.056 4＞0.05，失拟项检验不显著，表明当前方程的拟合效果合格，说明去掉X1X2、X2X3项获得的新方程能获得更好的拟合效果，即C/N与CaCl2添加量、CaCl2添加量与接种量的交互作用不显著，接种量与C/N交互作用对中性蛋白酶酶活力的影响显著。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3 响应面优化最佳组合条件

由方差分析可知，得到C/N与CaCl2添加量、CaCl2添加量与接种量的交互作用不显著，因此只分析接种量与C/N交互作用对中性蛋白酶酶活力的影响，等高线和响应面图见图8。由图8可知，等高线中的最小椭圆的中心点即是响应面的最高点，当CaCl2添加量为0.44 g/L时，C/N与接种量交互作用存在稳定点，即极大值点。

图8 接种量与C/N交互作用对中性蛋白酶酶活力影响的响应曲面和等高线Fig.8 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum and C/N on neutral protease activity

利用该模型预测的最佳试验条件为：C/N为1.24，参考单因素中葡萄糖和豆粕粉的试验结果，得到葡萄糖用量为50 g/L，豆粕粉用量为40.32 g/L，或葡萄糖用量为49.6 g/L，豆粕粉用量为40.32g/L的两种情况，由于这两组数值与单因素试验中所获得数据相差不大，为了方便实际应用，将C/N调整为1.25，即葡萄糖用量为50g/L、豆粕粉40g/L、CaCl2添加量为0.44 g/L，接种量为6.17%，可以得到最大酶活为193.436 U/mL。

2.2.4 验证最佳条件

根据单因素试验及响应面优化最佳组合条件，结合实际操作情况，将最佳条件修订为：C/N为1.25，即葡萄糖用量为50 g/L，豆粕粉40 g/L，CaCl2添加量为0.44 g/L，接种量6.0%，初始pH值为7.0，40℃发酵40 h，在此条件下进行3次验证试验，中性蛋白酶平均酶活为192.7 U/mL，与预测值193.436 U/mL非常接近。因而，这个模型是相当准确的，也表明响应面法适用于解淀粉芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵工艺的优化。

3 结论

本试验在单因素试验的基础上，应用响应面法对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）GZUB-7产中性蛋白酶发酵条件进行了优化。结果表明，产中性蛋白酶的最佳发酵培养基为葡萄糖用量为50g/L、豆粕粉用量为40g/L、CaCl2添加量为0.44g/L，最佳发酵条件为发酵温度40℃、初始pH 7.0、接种量为6.0%、发酵时间40 h，在此条件下，通过验证试验，所得中性蛋白酶酶活力平均值为192.7 U/mL，与预测值（193.44 U/mL）相接近。为进一步探索解淀粉芽孢杆菌产中性蛋白酶机理及所产中性蛋白酶的酶学性质提供理论基础。

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Optimization of fermentation conditions of neutral protease-producingBacillus amyloliquefaciens by response surface methodology

XU Zhaoxin1,ZENG Hui2,ZENG Deyong1,3,CAO Wentao1*,WANG Furong1,XI Dezhou1
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Guizhou Chengshijiaxiu Wine Co.,Ltd., Guiyang 550004,China;3.Kweichow Moutai(Group)Ecological Agriculture Development Co.,Ltd.,Qiandongnan 557500,China)

In order to improve the neutral protease activity,on the basis of single factor experiments,the fermentation conditions of neutral protease-producingBacillus amyloliquefaciensGZUB-7 were optimized by response surface methodology.The results showed that the optimum components of fermentation medium were glucose 50 g/L,soybean cake powder 40 g/L and CaCl20.44 g/L;the optimum fermentation conditions were fermentation temperature 40℃,initial pH 7.0,inoculum 6.0%and fermentation time 40 h.Under the conditions,the neutral protease activity was up to 192.7 U/ml.

Bacillus amyloliquefaciens;neutral protease;response surface methodology;conditions optimization

TS261.1

0254-5071（2017）04-0078-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.017

2016-04-27

贵州省科技厅工业公关项目（20113015）

许曌昕（1991-），女，硕士研究生，研究方向为微生物与发酵技术。

*通讯作者：曹文涛（1967-），男，教授，本科，研究方向为微生物学。