苯酚污染对蚯蚓抗氧化酶系活性及同工酶组分的影响

武金霞，范君姣，赵敬敬，张贺迎

(1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.河北大学 生物技术研究中心，河北 保定 071002)



苯酚污染对蚯蚓抗氧化酶系活性及同工酶组分的影响

武金霞1，范君姣1，赵敬敬1，张贺迎2

(1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.河北大学 生物技术研究中心，河北 保定 071002)

采用滤纸接触法，研究了不同质量浓度、不同时间苯酚污染胁迫对赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性及同工酶组分的影响，为研究酚类化合物对土壤污染的生物学诊断和风险评价提供科学依据.结果表明，苯酚对蚯蚓SOD、POD和CAT活性及同工酶组分具有显著的影响，不同质量浓度苯酚可显著提高蚯蚓CAT活力，改变蚯蚓SOD、POD同工酶组分，低质量浓度苯酚可提高蚯蚓SOD和POD活力，高质量浓度则会降低其活力.

苯酚；蚯蚓；超氧化物歧化酶(SOD)；过氧化物酶(POD)；过氧化氢酶(CAT)

酚类化合物是一类使用范围极其广泛的有机物[1-3],但是，一些高毒性酚类化合物如苯酚的使用会污染到土壤及环境，威胁到生态环境及人类健康[4].苯酚已被多个国家纳入重点控制污染物名单[5-6]，因此对其污染检测非常重要.

蚯蚓是典型的土壤动物，其数量占土壤动物生物量的60%～80%[7]，其体内组织可以富集许多杀虫剂和重金属，因而常被用来监测和评价土壤污染状况[8-9].蚯蚓体内的SOD、POD和CAT等抗氧化酶的活性经常会受到环境健康状况的影响，成为生态毒理学研究的热点[10-11].目前关于蚯蚓抗氧化酶系的研究中，对农药、金属离子研究的报道较多[12-14]，少见酚类化合物对其影响的报道，且多数只是研究污染物对蚯蚓抗氧化酶系活力的影响[15-17]，鲜有对其同工酶组分变化的研究.因此本实验以苯酚为污染物，研究其对蚯蚓抗氧化酶系活性及同工酶组分的影响，为蚯蚓在土壤污染生态评估中的应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试蚯蚓

赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)，购自天津某蚯蚓养殖公司.驯化后选取成熟健壮、体重200～300 mg的蚯蚓作为实验材料.

1.1.2 主要试剂

磷酸盐缓冲液， Tris-HCl 缓冲液，5.68 g/L的邻苯三酚，50 g/L的 Vc，2 g /L的H2O2，2 g/L的愈创木酚，8.6 g/L的生理盐水.

1.1.3 主要仪器

分光光度计(721，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；超高速冷冻离心机(GL-22LM，湖南星科科学仪器有限公司)；电子天平(FA2004，上海仪器仪表厂)；光照培养箱(LRH-250-G，广东省医疗器械厂).

1.2 实验方法

1.2.1 蚯蚓清肠

将滤纸用蒸馏水浸湿，铺在平皿底部，将待试蚯蚓用蒸馏水冲洗干净，放在平皿中，封口并扎孔，暗处放置24h后用蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸干体表水分[18].

1.2.2 蚯蚓染毒

参考国际标准方法组织草案(OECD-1984Earthwormacutetoxicitytests.ChemicalTestingGuideline207)指南，采用滤纸接触法对蚯蚓进行染毒.根据预实验确定的毒物质量浓度，配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L的苯酚溶液.取不同质量浓度的苯酚溶液各4mL，倒入平皿中，使滤纸湿润均匀，用保鲜膜将培养皿封口，在阴暗处平衡2h.取已清肠、生长状况相似的10条蚯蚓用蒸馏水冲洗干净，吸干体表水分，放入已加入苯酚溶液的培养皿中，封口并扎孔，(20±1)℃避光培养，每个处理质量浓度做3个平行实验.对照组以蒸馏水代替苯酚溶液进行同样的处理.

1.2.3 蚯蚓抗氧化酶活性测定

粗酶液制备:在实验进行的第24、48、72h将每一个平皿内的蚯蚓在蒸馏水中浸泡洗净，吸干水分，剪成小段，在研钵中加1g蚯蚓小段及3mL磷酸盐缓冲液，再加入适量石英砂，研磨至匀浆，4 ℃环境下将匀浆离心20min(10 000r/min)，最终得到的上清液即粗酶液.每个处理质量浓度共得3管粗酶液[18].

酶活性测定：SOD活性测定参考Marklund等[19]的方法，一个活性单位为抑制邻苯三酚自氧化率达到一半所需要的酶量.POD活性测定参考Kochba等[20]的方法，一个活性单位为每min每mg组织蛋白470nm处吸光度值升高0.01需要的酶量.CAT活性测定参考Song等[21]、张丽娜[22]的紫外吸收法，一个活性单位为每minH2O2240nm处吸光值下降0.1需要的酶量.蛋白含量采用Folin-酚法测定.

1.2.4 同工酶条带分析

SOD和POD同工酶检测参考王兰[23]、武金霞[24]等人的方法，CAT同工酶检测配制分离胶时添加胶液总体积0.3%的可溶性淀粉.

1.2.5 数据分析

所得数据利用Excel2003及SPSS13.0软件进行分析.

2 结果与讨论

2.1 苯酚对蚯蚓SOD活性及组分的影响

由图1可以看出，随着苯酚质量浓度的升高，蚯蚓的SOD活力先增强后减弱，随处理时间的延长，SOD活力逐渐下降.0.2g/L苯酚处理24h时，蚯蚓SOD活力达到最高112U/mL，表明在0.2g/L苯酚处理24h时，蚯蚓体内清除自由基的能力最强，反应了机体对轻度氧化胁迫的适应性，之后随着处理质量浓度的不断增大及处理时间的不断延长，蚯蚓SOD活性下降，表现出明显的抑制效应，当污染物质量浓度过高或污染时间过长时，超出蚯蚓自身修复范围，最终受到活性氧的损害，反应了蚯蚓自身修复系统的局限性.曹佳等[25]研究异噁草酮对蚯蚓抗氧化酶影响时发现，随着污染物质量浓度的升高，蚯蚓SOD活性先升高后降低，与本实验结果有相似之处.

由图2可以看出，低质量浓度、短时间苯酚处理组均有2条酶带，迁移率较小的条带记为SOD1，迁移率较大的记为SOD2.由图2b可以看出，在处理第48h时，随着苯酚质量浓度的升高，酶带先变亮后变暗，说明SOD活性随苯酚质量浓度的上升先增强后减弱，与图1的结果一致.48h及72h0.5g/L苯酚处理组只有SOD1显示活性.而当污染物质量浓度高或污染时间较长时，会抑制SOD酶活力，甚至导致酶带消失.

不同小写字母表示不同处理的显著性差异(P<0.05)，下同.图1 不同处理下蚯蚓的SOD活力Fig.1 Activity of SOD enzyme of earthworm under different treatments

处理时间分别为a.24 h;b.48 h;c.72 h.泳道由左到右依次为对照、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L组.图2 不同处理下蚯蚓的SOD同工酶组分Fig.2 SOD isozymes composts of earthworm under different treatments

2.2 苯酚对蚯蚓POD活性的影响

图3说明，同一时间处理下，蚯蚓的POD活性随着苯酚质量浓度的上升，呈先上升后下降的变化规律，Liu[26]等人研究佳乐麝香对蚯蚓影响时发现，当佳乐麝香质量浓度为0.015 7 μg/ mL时， POD活性出现最高值，之后开始下降，与本结果相似.而当苯酚质量浓度为0.4、0.5 g/L时，随着时间延长蚯蚓POD活力呈上升趋势，在0.3 g/L苯酚处理72 h时，POD活力最高，为21.63 U/mg.这说明，少量的苯酚可诱导机体产生更多的POD来抵抗这种环境胁迫，而当有机物的刺激强度超过一定阈值时，就会对体内POD造成中毒性损害，蚯蚓POD活力随苯酚污染时间延长而升高则反映了机体利用自身修复系统来抵御污染物的胁迫.

从图4可以看出，对照组有2条酶带(POD1和POD2)，苯酚处理时，蚯蚓POD1条带消失；随苯酚质量浓度的升高，24 h处理组中，POD2活性先降低后升高，48 h处理组的POD活性则先升高后降低，72 h处理组的POD活性逐渐降低，与图3结果有明显区别，说明通过同工酶法测定酶活性有一定的局限性.同时，本实验结果说明，蚯蚓体内POD1对苯酚比较敏感，较低质量浓度就会导致其失活，POD2在抵御苯酚污染胁迫时起主要作用.整个过程中既有POD同工酶组成的变化也有各成分相对活性的变化，说明蚯蚓可以通过这种调整，减少污染物对自身系统带来的损害.

图3 不同处理下蚯蚓的POD活力Fig.3 Activity of POD enzyme of earthworm under different treatments

处理时间分别为a.24 h;b.48 h;c.72 h.泳道由左到右依次为对照、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L组.图4 不同处理下蚯蚓POD同工酶组分Fig.4 POD isozymes composts of earthworm under different treatments

2.3 苯酚对蚯蚓CAT活性的影响

由图5可见，除0.5 g/L苯酚处理24 h外，其他处理组CAT活性均高于对照组，说明苯酚对蚯蚓CAT具有诱导作用.而且这种诱导效应随着时间的延长逐渐加强，随着处理质量浓度的升高先增强后减弱.这说明，在本次实验剂量范围内，苯酚的存在使蚯蚓CAT活性提高，从而减少过多的H2O2对蚯蚓机体造成的损伤，这是生物应激性的体现.

从图6可以看出，所有处理组都只有1条CAT酶带，且随着苯酚质量浓度的升高，CAT酶带变亮，活性升高，图5及图6说明，苯酚对蚯蚓CAT酶活性具有激活作用，与曹佳等[26]的结论一致，说明与 SOD、 POD相比， CAT对苯酚的耐受能力较高.

图5 不同处理下蚯蚓的CAT活力Fig.5 Activity of CAT enzyme of earthworm under different treatments

处理时间分别为a.24 h;b.48 h;c.72 h.泳道由左到右依次为对照、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L组.图6 不同处理下蚯蚓CAT同工酶组分Fig.6 CAT isozymes composts of earthworm under different treatments

3 结论

1) 低质量浓度、短时间苯酚污染可以提高蚯蚓SOD活力，高质量浓度长时间污染则会降低其活力.

2) 蚯蚓的POD酶活性随着苯酚质量浓度的上升，先上升后下降，其同工酶组分也会受苯酚污染的影响，POD1对苯酚比较敏感，较低质量浓度就会导致其失活.

3)苯酚对蚯蚓CAT活性有显著的激活作用，这种激活作用随着苯酚质量浓度的加大先强后弱.

[1] LI Z C,TANG W R ,ZHU J K,et al.Simultaneous determination of phenolic pollutants in waste water using CE-AD[J].Journal of East China Normal University(Natural Science),2013(1):128-138.DOI:10.3969/j.issn.1000-5641.2013.01.016.

[2] 郑龙珍,董泽民,熊乐艳，等.WC/TiO2纳米复合界面光催化剂制备及其光催化降解酚类污染物研究[J].环境科学学报,2014,34(11):2806-2814.DOI:10.13671/j.hjkxxb.2014.0596. ZHENG L Z,DONG Z M,XIONG L Y,et al.Preparation of WC/TiO2nanocomposite interfacial photocatalyst and its photocatalytic degradation of phenol pollutant[J].Acta Scientiae Circumstantiae,2014,34(11):2806-2814.DOI:10.13671/j.hjkxxb.2014.0596.

[3] 殷焕顺.纳米材料修饰电极对土壤及水中酚类污染物的检测研究[D].泰安:山东农业大学,2012.DOI:10.7666/d.y2117170. YIN H S.Determination of phenolic in soil and water samples based on nanomaterials modified electrodes[D].Taian:Shandong Agricultural University,2012.DOI:10.7666/d.y2117170.

[4] 胡婷,谷洁,甄丽莎,等.石油污染土壤中苯酚降解菌ad049的鉴定及降解特性[J].生态学报,2014,34(5):1140-1148.DOI:10.5846/stxb201306091528. HU T,GU J,ZHEN L S,et al.Identification and characteristics of phenol degrading bacteria ad049 screened from oil contaminated soil[J].Acta Ecologica Sinica,2014,34(5):1140-1148.DOI:10.5846/stxb201306091528.

[5] MOYERS B,WU J S.Removal of organic precursors by permanganate oxidation and alum coagulation[J].Water Research,1985,19(3):309-314.DOI:10.1016/0043-1354(85)90090-9.

[6] 张菊萍,陆少鸣,徐姮,等.臭氧-生物活性炭净水工艺处理苯酚污染的应急效果及影响因素分析[J].环境工程学报,2015,9(6):2745-2749． ZHANG J P,LU S M,XU H,et al.Phenol pollution emergency treatment and influencing factors of O3-BAC process[J].Chinese Journal of Environmental Engineering,2015,9(6):2745-2749．

[7] 周垂帆,王玉军,俞元春,等.铜和草甘膦对蚯蚓的毒性效应研究[J].中国生态农业学报,2012,20(8):1077-1082.DOI:10.3724/SP.J.1011.2012.01077. ZHOU C F,WANG Y J,YU Y C,et al.Cu and glyphosate toxicity to earthworm(Eiseniafetida)[J].Chinese Journal of Eco-Agriculture,2012,20(8):1077-1082.DOI:10.3724/SP.J.1011.2012.01077.

[8] ACHAZI R K,FLENNER C,LIVINGSTONE D R,et al.Cytochrome P450 and dependent activities in unexposed and PAH-exposed terrestrial annelids[J].Comparative Biochemistry and Physiology,1998,121(1):339-350.DOI:10.1016/S0742-8413(98)10055-5.

[9] 孙仕仙,陶瑞,张庆蛟,等.乐果和杀虫双污染对蚯蚓体内蛋白质含量的影响[J].江西农业大学学报，2012,34(2):298-303.DOI:10.3969/j.issn.1000-2286.2012.02.018. SUN S X,TAO R,ZHANG Q J,et al.Effects of dimethoate and dimehypo pollution on protein content of earthworm[J].Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis,2012,34(2):298-303.DOI:10.3969/j.issn.1000-2286.2012.02.018.

[10] LUO Y,ZANG Y,ZHONG Y,et al.Toxicological study of two novel pesticides on earthworm(Eiseniafoetida)[J].Chemosphere,1999,39(13):2347-2356.DOI:10.1016/S0045-6535(99)00142-3.

[11] LIN D S,XIE X J,ZHOU Q X,et al.Biochemical and genotoxic effect of triclosan on earthworms(Eiseniafetida)using contact and soil tests[J].Environ Toxicol,2012,27:385-392.DOI:10.1002/tox.20651.

[12] GUO Y Y,LIU T,ZHANG J,et al.Biochemical and genetic toxicity of the ionic liquid 1-octyl-3-methylimidazolium chloride on earthworms(Eiseniafetida)[J].Environmental Toxicology and Chemistry,2016,35(2):411-418.DOI:10.1002/etc.3198.

[13] JEYANTHI V,PAUL J A J,SELVI B K,et al.Comparative study of biochemical responses in three species of earthworms exposed to pesticide and metal contaminated soil[J].Environ Process,2016,3:167-178.DOI:10.1007/s40710-016-0131-9.

[14] FENG L,ZHANG L,ZHANG Y N,et al.Inhibition and recovery of biomarkers of earthworm(Eiseniafetida)after exposure to thiacloprid[J].Environ Sci Pollut Res,2015,22:9475-9482.DOI:10.1007/s11356-015-4122-6.

[15] DUAN X C,XU L,SONG J,et al.Effects of benzo[a]pyrene on growth,the antioxidant system,and DNA damage in earthworms(Eiseniafetida)in 2 different soil types under laboratory conditions[J].Environmental Toxicology and Chemistry,2015,34(2):283-290.DOI:10.1002/etc.2785.

[16] MA T T,CHEN L K,WU L H,et al.Oxidative stress,cytotoxicity and genotoxicity in earthwormEiseniafetidaat different di-n-butyl phthalate exposure levels[J].PLoS ONE,2016,11(3):1-11.DOI:10.1371/journal.pone.0151128.

[17] ZHANG W,LIU K,LI J,et al.Uptake and depuration kinetics of lead(Pb)and biomarker responses in the earthwormEiseniafetidaafter simultaneous exposure to decabromodiphenyl ether(BDE209)[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2015,113:45-51.DOI:10.1016/j.ecoenv.2014.11.014 .

[18] 潘书娟.苯酚和汞污染对蚯蚓抗氧化酶和金属硫蛋白基因表达的影响[D].保定:河北大学,2011. PAN S J.Effect of phenol and hydrargrum ion on the antioxide enzymes and gene expression of metallothionein inEiseniafoetidaearthworm[D].Baoding:Hebei University,2011.

[19] MARKLUND S,MARKLUND G.Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase[J].European Journal of Biochemistry,1974,47:469-479.DOI:10.1111/j.1432-1033.1974.tb03714.x.

[20] KOCHBA J,LAVEE S,SPIEGEL-ROY P.Differences in peroxidase activity and isoenzymes in embryogenic and nonembryogenic “Shamouti” orange ovular callus lines[J].Plant Cell Physiol,1977,18:463-467.

[21] SONG Y,ZHU L S,XIE H,et al.DNA damage and effects on antioxidative enzymes in earthworm(Eiseniafetida)induced by atrazine[J].Soil Biology and Biochemistry,2009,41(5):905-909.DOI:10.1016/j.soilbio.2008.09.009.

[22] 张丽娜.Fe2+、Mn2+胁迫对西洋参生长的影响[D].北京:中国农业科学院,2013. ZHANG L N.Effects of Fe2+and Mn2+stress on the growth ofPanaxquinquefoliumL[D].Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences,2013.

[23] 王兰,李涌泉,闫博,等.Cd对河南华溪蟹(Sinopotamonhenanense)主要组织器官SOD和POD同工酶的影响[J].应用与环境生物学报,2007,13(6):823-829.DOI:10.3321/j.issn:1006-687x.2007.06.015. WANG L,LI Y Q,YAN B,et al.Effect of Cadmium on SOD and POD isozyme in tissues of fresh water crab(Sinopotamonhenanense)[J].Chin J Appl Environ Biol,2007,13(6):823-829.DOI:10.3321/j.issn:1006-687x.2007.06.015.

[24] 武金霞,张贺迎,张瑞英,等.生物化学实验原理与技术[M].保定:河北大学出版社,2005:78-80.

[25] 曹佳,刁小平,胡继业,等.异噁草酮对蚯蚓抗氧化酶活性剂DNA损伤的研究[J].农业环境科学学报,2013,32(5):925-931.DOI:10.11654/jaes.2013.05.007. CAO J,DIAO X P,HU J Y,et al.Effects of clomazone on antioxidative enzymes activity and DNA damage of earthworm(Eiseniafoetida)[J].Journal of Agro-Environment Science,2013,32(5):925-931.DOI:10.11654/jaes.2013.05.007.

[26] LIU S,ZHOU Q,CHEN C.Antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation in erathworm(Eisenafetida)exposedto1,3,4,6,7,8-hexahydro-4,6,6,7,8,8-hexamethyl-cylopenta-γ-2-benzopyran[J].Environmental Toxicology,2012,27(7):472-479.DOI:10.1002/tox.20661.

(责任编辑：赵藏赏)

Effect of phenol on antioxidant enzymes activity and isozymes composition ofEiseniafoetida

WU Jinxia1,FAN Junjiao1,ZHAO Jingjing1,ZHANG Heying2

(1.College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China;2.Research Center for Biotechnology,Hebei University,Baoding 071002,China)

The filter paper contacting test was conducted to detect the activity and isozymes composition of SOD,POD and CAT ofEiseniafoetidaexposured with phenol,to provide scientific basis for biological diagnosis and risk assessment of soil pollution by phenol compounds.The results suggested that the CAT activity was activated markedly at different concentrations；the SOD and POD isozymes composition was changed; the SOD and POD activity were induced prominently at low concentration but inhibited at high concentration.

phenol；earthworm；SOD；POD；CAT

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.02.008

2016-06-30

河北省生物工程重点学科资助项目(1050-5030023)

武金霞(1966—)，女，河北保定人，河北大学教授，博士，主要从事生化药物及基因工程药物研究. E-mail：wjx6@163.com

张贺迎(1966—)，男，河北大城人，河北大学副研究员，主要从事生化药物及基因工程药物研究. E-mail：z660128@163.com

X835

A

1000-1565(2017)02-0155-06