柔肝颗粒的定性定量方法优化研究

陈春莺，邹恺平，2，施 敏△

（1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029； 2.南京中医药大学，江苏 南京 210023）

·实验研究·

柔肝颗粒的定性定量方法优化研究

陈春莺1，邹恺平1，2，施 敏1△

（1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029； 2.南京中医药大学，江苏 南京 210023）

目的补充优化柔肝颗粒的薄层色谱（TLC）鉴别及含量测定方法，提高质量标准。方法 采用TLC法对制剂中赤芍、三七、白术进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法测定制剂中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。结果 TLC法鉴定专属性强，阴性无干扰；毛蕊异黄酮葡萄糖苷的质量浓度在0.981～19.62 αg／mL范围内与峰面积线性关系良好，r＝0.999 7（n＝6），平均回收率为 99.62%，RSD＝1.69%（n＝6）。结论 该方法准确、快速、稳定、可靠、重复性好，可用于柔肝颗粒的质量控制及评价。

柔肝颗粒；薄层色谱法；高效液相色谱法；毛蕊异黄酮葡萄糖苷；质量标准

柔肝颗粒由黄芪、赤芍、炒白术、当归、三七等中药组方，方中以黄芪为君药，当归、白术为臣药，具有补益肝肾、补气健脾之功效，为南京中医药大学附属医院消化科根据多年临床经验，以柔肝健脾、益肾活络为法拟订的成方。现代药理研究表明，黄芪、当归具有保护肝细胞的作用[1]，赤芍、牛膝、三七也对肝损伤有一定保护和治疗作用[2]。有研究表明，柔肝颗粒具有较好的抗实验大鼠肝纤维化作用，能减轻肝细胞损伤，从而有效地保护肝细胞[3]。柔肝颗粒为医院院内制剂，其质量标准与新药要求相去甚远。本研究中，按新药审批的技术要求，在柔肝颗粒原质量标准的基础上，增加了三七、白术的薄层色谱（TLC）鉴别方法，并进行了方法学考察，对原标准中赤芍的鉴别进行了修订，增加了方中君药黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定项。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

WD-9413A型凝胶成像分析仪（北京市六一仪器厂）；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备仪器厂）；KQ-1000E型医用超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；Agilent1260S型高效液相色谱仪，包括G1312C型二元泵，G1316A型柱温箱，G1315D型DAD检测器，Chemstation色谱工作站，G1367E型自动进样器(美国Agilent公司)；BP211D型电子分析天平（德国Sartorius公司）。

1.2 试药

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号为111920-201304，中国食品药品检定研究院）；柔肝颗粒（批号分别为 1607001，1607002，1608003，江苏省中医院制剂部）；赤芍对照药材（批号为121093-200402）、三七对照药材（批号为 120941-200506）、白术对照药材（120925-200407）购自中国食品药品检定研究院；水为超纯水，甲醇为色谱纯，其他化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 赤芍

溶液制备：取柔肝颗粒5 g，研细，加乙醇10 mL，超声5 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液；同法制备阴性对照品溶液；取芍药苷对照药材粉末0.5 g，按赤芍供试品溶液同法制备，作为对照药材溶液。

薄层色谱鉴别：照薄层色谱法，精密吸取上述3种溶液各4 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色斑点，阴性无干扰。详见图1。

图1 赤芍薄层色谱图谱

2.1.2 三七

溶液制备：取柔肝颗粒5 g，研细，加水搅匀，再加水饱和的正丁醇5 mL，振摇，静置，取上层溶液，加3倍量正丁醇饱和的水，摇匀使分层，取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；同法制备阴性对照品溶液；取三七对照药材粉末0.5 g，按三七供试品溶液同法制备，作为对照药材溶液。

薄层色谱鉴别：照薄层色谱法试验，精密吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-丙酮（5∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷10%硫酸乙醇液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品药材溶液色谱相同位置上显相同颜色斑点。详见图2。

2.1.3 白术

溶液制备：取柔肝颗粒5 g，研细，加正己烷15 mL，超声处理15 min，合并正己烷提取液，挥干，残渣加5 mL乙醇溶解，作为供试品溶液；同法制得阴性对照品溶液；取白术对照药材粉末1g，加正己烷4mL，超声15min，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。

薄层色谱鉴别：照薄层色谱法（附录ⅥB）试验，精密吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于硅胶G薄层板上，用环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（2∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯365 nm波长下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点。详见图3。

图2 三七薄层色谱图

图3 白术薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Hedera ODS-2 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：流动相A为0.2%甲酸溶液，流动相B为乙腈，按表1进行梯度洗脱；流速：1.0 mL／min；柱温：30℃；检测波长：260 nm；进样量：10 μL。

分别精密吸取2.2.2项下3种溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定，结果阴性对照无干扰。色谱柱的理论板数以毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于3 000，分离度大于1.5。结果见图4。

表1 流动相梯度洗脱程序表

2.2.2 溶液制备

对照品溶液：取经五氧化二磷减压干燥24 h的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品9.81 mg，精密称定，置5 mL容量瓶中，加甲醇适量，溶解，并稀释至刻度，作为贮备液；精密吸取贮备液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇适量，稀释至刻度，即得。

图4 毛蕊异黄酮葡萄糖苷高效液相色谱图

供试品溶液：称取样品约1.0 g，研细后精密称定，置10 mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声15 min（功率280 W，频率53 kHz），加甲醇，稀释到刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：取黄芪的缺味阴性制剂，依法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

线性关系考察：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液，分别稀释成质量浓度为 0.981，1.962，2.452，4.905，9.810，19.620 μg／mL的溶液，精密吸取不同质量浓度的对照品溶液各10 μL，测定峰面积积分值，以质量浓度(X，μg／mL)对峰面积积分值(Y)进行线性回归，得回归方程 Y＝30.199 X-0.183 9，r＝0.999 7 (n＝6)。结果表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度在0.981～19.620 μg／mL范围内与峰面积积分值线性关系良好。详见表2。

精密度试验：精密吸取2.2.2项下混合对照品溶液，连续进样6次，测定，记录峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品峰面积的 RSD＝0.40＜5%(n＝6)，表明仪器精密度良好，详见表3。

重复性试验：按处方量平行称取同一批样品共6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，进样，测定。结果样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷平均含量为4.40 μg／mL，RSD＝0.46%＜5%(n＝6)，表明方法重复性良好。详见表4。

表2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷的线性关系考察结果(n＝6)

表3 毛蕊异黄酮葡萄糖苷日内精密度考察结果（n＝6）

表4 重复性试验结果（n＝6）

稳定性试验：取同一份供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h时进样测定，计算峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的 RSD＝2.19%＜5%(n＝6)，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。详见表5。

加样回收试验：称取柔肝颗粒（批号为1607002）2 g，精密称定，共6份，置50 mL容量瓶中，精密加入一定量的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液，加甲醇定容至刻度，摇匀，过膜，进样测定，并计算回收率。结果见表6。

表5 稳定性试验结果（n＝6）

2.2.4 样品含量测定

取不同批号柔肝颗粒（批号分别为 1607001，1607002，1608003），依法制备供试品溶液，每批取3份，依法进样测定。结果见表7。

3 讨论

本研究对方中多味药材进行了薄层色谱鉴别，由于药材种类较多，中药饮片的成分复杂，不同药材可能含有相同的化学成分，仅以化学成分对照品为参考，特别是该成分为其非专属性成分时，难以作为饮片的定性鉴别依据。故本研究中建立的TLC鉴别方法使用对照药材作为参考，增强了定性鉴别的准确性与可靠性。

表6 加样回收试验结果（n＝6）

表7 3批柔肝颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定结果

本制剂功能柔肝健脾、活血通络，用于肝硬化之正气亏虚、肝脾血瘀证。黄芪为方中君药，主要含皂苷类、黄酮及其苷类和多糖类成分[4-5]。黄酮类成分有改善血循环和提高免疫力的作用，其中毛蕊异黄酮葡萄糖苷活性较高，为主要有效成分，有抗病毒、抗菌、调血脂、抗氧自由基等作用，还有抗缺血和改善血常规作用[6]。现在多采用HPLC法测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量[6-8]。本研究中所建立的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定方法，经方法学考察表明，其专属性强，重复性好，可用于柔肝颗粒的质量控制。黄芪甲苷作为药材黄芪的质量评价指标之一，其检测方法多采用蒸发光散射检测器（ELSD）法，由于样品处理方法复杂，含量测定稳定性差，故不作为黄芪含量的测定方法。

本研究中对柔肝颗粒原质量标准进行了优化，对赤芍的鉴别进行了方法学研究，建立了三七、白术的TLC鉴别方法和黄芪中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷HPLC含量测定法。以上3味药材的薄层色谱定性鉴别，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的定量研究，经3批样品验证考察，方法专属性强，阴性无干扰，灵敏度高，重复性好。通过定性和定量2种方法的结合，可更科学、合理、全面地进行质量评价，故可作为该制剂质量标准制订的可靠依据。

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Improvement of Qualitative and Quantitative M ethods for Rougan Granules

Chen Chunying1，Zou Kaiping1，2，Shi Min1
（1.Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu，China 210029； 2.Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu，China 210023）

Objective To impove the quality standard of Rougan Granules.M ethods Thin layer chromatography（TLC）method was used to identify Radix Paeoniae Rubra，Notoginseng and Atractylodes in Rougan Granules.The content of calycosin-7-glucoside was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）method.Results The TLC spots were clear with strong specificity and free of interference of negative samples.The linear range of calycosin-7-glucoside was 0.981-19.62 μg／mL，r＝0.999 7（n＝6）.The average recovery rate of calycosin-7-glucoside was 99.62%，RSD＝1.69%（n＝6）.Conclusion The method is accurate，rapid，reliable，and stable with good repeatability，it can be used to control and evaluate the quality standard of Rougan Granules.

Rougan Granules；TLC；HPLC；calycosin-7-glucoside；quality standard

R284.1；R256.4

A

1006-4931(2017)06-0015-05

2016-12-08)

10.3969／j.issn.1006-4931.2017.06.005

陈春莺，女，主管中药师，研究方向为医院制剂质量控制，（电话）025-86614204。

△通讯作者：施敏，女，副主任中药师，研究方向为医院制剂质量控制，（电子信箱）romantic.fieworks＠163.com。