正交试验法优选地 提取工艺

张 博，韩红园，王宝丽，李彤彤，林瑞超

（北京中医药大学中药学院·中药品质评价中心·北京市重点试验室，北京 100102）

·实验研究·

正交试验法优选地 提取工艺

张 博，韩红园，王宝丽，李彤彤，林瑞超

（北京中医药大学中药学院·中药品质评价中心·北京市重点试验室，北京 100102）

目的优选地 中牡荆素、异牡荆素、芦丁的提取工艺。方法 采用 L9（34）正交试验设计，以地 中牡荆素、异牡荆素、芦丁含量为考察指标，对超声时间、超声功率、甲醇浓度、液料比4个因素进行考察，采用多指标综合评分法对试验结果进行评价及方差分析。优选最佳工艺条件，采用高效液相色谱法进行验证。结果最佳提取工艺为在140 W超声功率下，以40倍80%甲醇超声提取35 min。结论 该试验设计合理，结果重复性好，可为地 的质量控制提供依据。

地 ；提取工艺；正交试验；牡荆素；异牡荆素；芦丁

地 为野牡丹科植物地 Melastoma dodecandrum Lour.的干燥全草，归肝、脾、胃、大肠经，有清热化湿、止痛止血等功效。现代药理研究表明，地 提取物有镇痛消炎、显著降低四氧嘧啶性糖尿病小鼠的血糖、调血脂、止血、抗氧化等作用[1－3]。研究表明，地 还可治疗肝炎、肝肿大、肾盂肾炎等疾病[4]。地 质量控制指标主要为没食子酸、槲皮素，但两者多在酸性条件下提取，容易发生水解，所测成分不能完全代表药材的质量。地 中主要含有黄酮类成分，已经分离、鉴别出约28种。本研究中首次采用 L9(34)正交试验法对地 中3种黄酮类成分牡荆素、异牡荆素、芦丁进行同时测定，并进行提取工艺研究，采用多指标综合评分法[6]对其提取工艺进行评价，可全面地反映地 药材的质量，为工业化生产及质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Alliance Waters e2695型高效液相色谱仪(美国沃特世公司，包括2998型二极管阵列检测器，Empower3.0色谱数据工作站)；Mettler MS105DU型电子分析天平(梅特勒－托利多仪器＜上海＞有限公司)；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FW－200型高速万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.2 试药

牡荆素对照品（批号为PS14070702，纯度为99.64%），异牡荆素对照品（批号为PS14042202，纯度为99.66%），芦丁对照品（批号为PS16011302，纯度为95.95%），均购自成都普思生物科技股份有限公司；甲醇为色谱纯（美国Fisher公司）；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。试验用地 全草产自福建，经北京中医药大学林瑞超教授鉴定为野牡丹科植物地 Melastoma dodecandrum Lour.的干燥全草。

2 方法与结果

2.1 黄酮类成分含量测定

2.1.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Agilent Zorbax SB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇(A)－0.2%甲酸水（B）溶液，梯度洗脱（0～3 min，5%～40%A；3～20 min，40%A）；检测波长：354 nm；柱温：29℃；流速：1 mL／min；进样量：15 μL。在此色谱条件下，各成分色谱峰分离度良好，色谱图见图1。

2.1.2 溶液制备

对照品溶液：称取牡荆素对照品5.53 mg，精密称定，异牡荆素对照品5.63 mg，芦丁对照品2.74 mg，分别置25，10，10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得各对照品贮备液。分别精密吸取上述对照品贮备液牡荆素3 mL，异牡荆素2 mL，芦丁1 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，配制成每1 mL含牡荆素0.066 36 mg，异牡荆素0.112 6 mg，芦丁0.027 4 mg的混合对照品溶液。保存于4℃冰箱，备用。

图1 高效液相色谱图

供试品溶液：取地 药材粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按正交试验方法进行超声提取，放冷，用提取溶剂补足减失的质量，摇匀，上清液用0.22 μm滤膜过滤，即得。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：精密吸取混合对照品溶液5，10，15，20，25 μL注入高效液相色谱仪，记录各峰面积。以被测物质量(X)对峰面积积分值(Y)进行线性回归，得牡荆素、异牡荆素、芦丁的回归方程分别为，Y＝2.37× 106X＋2.96×104（r＝0.999 9），Y＝2.28×106X＋4.39×104（r＝0.999），Y＝1.65×106X＋0.39×104（r＝1.000）。结果表明，牡荆素、异牡荆素、芦丁进样量分别在0.331 8～1.659 0 μg，0.563～2.815 μg，0.137～0.685 μg范围内与峰面积积分值线性关系良好。

精密度试验：精密吸取上述同一混合对照品溶液15 μL，重复进样6次。结果牡荆素、异牡荆素、芦丁平均峰面积的 RSD分别为1.18%，1.21%，1.48%（n＝6），表明仪器精密度较好。

重复性试验：称取同一批地 药材粉末约0.5 g，共6份，精密称定，依法制备供试品溶液并测定。结果牡荆素、异牡荆素、芦丁的平均含量分别为0.714，1.144，0.411 mg／g，RSD分别为1.61%，1.50%，1.86%（n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，16，24，36 h时进样。结果牡荆素、异牡荆素、芦丁平均峰面积的 RSD分别为1.19%，1.02%，1.63%（n＝7），表明供试品溶液在36 h内基本稳定。

加样回收试验：取同一批已知含量的地 药材粉末约0.25 g，精密称取 6份，依法制备供试品溶液并测定，计算牡荆素、异牡荆素、芦丁的加样回收率。结果见表1。

2.2 正交试验

2.2.1 正交试验设计

采用L9（34）正交试验表对超声时间（A）、超声功率（B）、甲醇浓度（C）、液料比（D）4个因素进行正交试验，以牡荆素、异牡荆素、芦丁含量为考察指标，采用综合评分法[6]对试验结果进行评价及方差分析。详见表2。

2.2.2 正交试验结果及方差分析

按照正交试验设计进行试验，采用综合评分法对试验进行分析。评分时以各指标的最大值为参照，将数据进行标准化处理，再给出不同权重[5]。设总权重系数为1.00，牡荆素（m1）、异牡荆素（m2）、芦丁（m3）分别占总系数的 1／3。综合评分 ＝（1／3）m1／m1max＋（1／3）m2／m2max＋（1／3）m3／m3max。综合评分越高，代表指标成分提取越完全。评分结果见表3。

表1 加样回收试验结果（n＝6）

由表4可见，影响地 提取工艺的因素依次为液料比＞甲醇浓度＞超声时间＞超声功率，极显著性影响因素为超声时间、甲醇浓度和液料比，显著性影响因素为超声功率。在此试验条件下，得最佳提取工艺为A2B1C2D2，即超声功率为140 W，加入40倍80%甲醇超声处理35 min。

表2 正交试验因素水平表

表3 L9(34)正交试验结果

表4 方差分析结果

表5 最佳工艺验证试验结果（mg／g）

2.3 工艺验证

取地 药材粉末3份，每份约0.5 g，精密称定，加入20 mL的80%甲醇，140 W超声处理35 min。按拟订色谱条件进样测定牡荆素、异牡荆素、芦丁的含量，结果见表5。

3 讨论

3.1 正交试验验证

本研究中以牡荆素、异牡荆素、芦丁的含量为考察指标，分析超声时间、超声功率、甲醇浓度、液料比对指标成分含量的影响，得最佳提取工艺组合为A2B1C2D2，即加入40倍80%甲醇，在140 W功率条件下超声处理35 min。4个因素对含量均有较大影响，差异有显著性。通过验证试验表明，提取工艺的方法简单可行，结果稳定可靠。

3.2 成分选择

考察指标选择牡荆素和异牡荆素，均为黄酮碳苷异构体，均有显著清除2－二苯基－1－苦肼基(DPPH)、抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及预防或治疗乳腺癌、前列腺癌等药理作用[6－7]；芦丁为黄酮苷，在抗病毒、抗炎、抑制肝癌细胞生长等方面作用显著[8－9]，是地

的有效成分。故选择其作为地 质量控制指标。

3.3 试验条件选择

预试验比较了超声与回流的提取效率，发现两者提取效率无显著性差异，但超声提取法有操作简单、提取温度低、节省时间等优点，故采用超声提取法。曾选择水、甲醇、乙醇作为提取溶剂，对地 进行提取，结果表明80%甲醇对指标成分的提取率最高，故选择80%甲醇作为提取溶剂。曾采用PDA检测器，于200～400 nm波长处对3种黄酮类成分进行全波长扫描，芦丁于354 nm波长处有最大吸收，且对牡荆素和异牡荆素吸收影响较小，故选择354 nm作为检测波长。

综上所述，中药具有多成分、多功效、多靶点等特点，这也决定了单一成分或指标评价难以表达中药的质量[10]，本试验中采用适当的试验方法和多指标综合评分方法，对地 药材质量进行控制，可为建立质量标准提供依据。

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Orthogonal Test for Optimization of Melastoma Dodecandrum Loureiro Extraction Process

Zhang Bo,Han Hongyuan,Wang Baoli,Li Tongtong,Lin Ruichao
(School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Chinese Medicine· Chinese Medicine Quality Evaluation Center·Beijing Key Laboratory,Beijing,China 100102)

Objective To optimize an appropriate extracting technology to extract vitexin,isovitexin and rutin from Melastoma dodecandrum Loureiro.M ethods According the yield of vitexin,isovitexin and rutin,the L9(34)orthogonal experimental design was used to optimize the process with ultrasonic time,ultrasonic power,methanol concentration,solvent ratio of inspection,and the results were analyzed by multi－index comprehensive weighted score evaluation.Choose the optimal conditions,and HPLC method was verified.Results The best extraction process was with 140 W power,40 times of 80% methanol,and ultrasonic extraction of 35 min.Conclusion The experimental design is reasonable with good results of the experiment reproducibility,which can provide scientific basis for its quality control.Key words:Melastoma dodecandrum Loureiro;extraction process;orthogonal experiment;vitexin;isovitexin;rutin

TQ460.6；R284.2

A

1006－4931(2017)05－0020－04

2017－01－08)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.05.005

张博(1992－)，女，在读硕士研究生，主要从事重要质量标准与药效学研究，（电子信箱）13521571837＠163.com。

林瑞超，教授，博士研究生导师，研究方向为中药与民族药品质评价，（电子信箱）linrch307＠sina.com。