补阳还五汤对Aβ诱导大鼠微血管内皮细胞凋亡保护作用

刘斌，刘国良，张宁，张红，张涛*，董晓红，周忠光

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

补阳还五汤对Aβ诱导大鼠微血管内皮细胞凋亡保护作用

刘斌1，刘国良1，张宁1，张红2，张涛2*，董晓红1，周忠光1

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

目的：研究补阳还五汤对Aβ诱导的大鼠微血管内皮细胞(PMVEC)凋亡的影响。方法：建立Aβ损伤大鼠微血管内皮细胞模型，不同浓度(0.1、1、10 μg/ml)补阳还五汤干预，MTT法检测大鼠微血管内皮细胞活力；western-blot法检测大鼠微血管内皮细胞中凋亡蛋白bax和caspase9表达水平。结果：补阳还五汤在浓度(0.1、1、10 μg/ml)能够抑制Aβ诱导的大鼠微血管内皮细胞bax和caspase9蛋白的表达并呈浓度依赖性。结论：补阳还五汤能够通过抑制凋亡蛋白bax和caspase9的表达而具有保护大鼠微血管内皮细胞的作用，可能成为是一种有效的抗脑血管系统疾病治疗剂。

补阳还五汤；bax；caspase9；大鼠微血管内皮细胞

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，又称老年痴呆，是一种以记忆逐步减退和进行性认知障碍为临床特征的中枢神经系统疾病。AD的主要病理特征为神经元丢失、老年斑(senile plaque，SP)、神经纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)和细胞外β淀粉样蛋白(Aβ)沉积[1-4]。近十多年来的研究表明,微血管内皮细胞(vascularendothelial cell,VEC)是一种具有广泛生物活性的细胞,它通过合成、分泌多种生物活性物质调节血管的通透性。微血管内皮细胞能够限制可溶性物质从血液进入大脑，是血脑屏障的主要组成部分，当VEC功能受损时,其功能失调,通透性改变,从而引起相关疾病的发生[5]。

中医认为AD属于“络病”范畴，补阳还五汤出自清代王清任的《医林改错》，由黄芪、当归、赤芍、桃仁、川芎、红花、地龙组成，诸药合用，共奏补气活血、通经活络之功效。现代药理研究表明，补阳还五汤具有改善脑血循环和微循环[6]，促进血管新生[7]、抗细胞凋亡[8-9]，对抗兴奋性氨基酸[10-11]等药理作用。补阳还五汤以往多用于治疗缺血性脑血管疾病[12-13],但其与微血管内皮细胞的作用关系如何，补阳还五汤是否可以通过抑制血管内皮细胞凋亡来达到抗老年痴呆的效果目前尚不清楚，特别是与凋亡因子bax和caspase9关系如何尚未见报道。本试验以补阳还五汤作用于大鼠微血管内皮细胞为研究对象，考察补阳还五汤对凋亡因子bax和caspase9表达的影响，探讨Caspase-9和Bax在AD发生中的作用。

1 材料与方法

1.1 补阳还五汤(BYHWD)粉剂制备

BYHWD由黑龙江中医药大学实验中心田明教授制备成干粉，4℃冰箱中保存。

1.2 大鼠脑血管内皮细胞的培养

大鼠脑血管内皮细胞(BMVEC)常规培养于含10%胎牛血清、双抗各1×105U/L的DMEM培养液中，置细胞培养室内，于37℃恒温、5% CO2、100%饱和湿度培养箱中培养。

1.3 Aβ25-35诱导脑微血管内皮细胞损伤构建

将冻干粉5 mgAβ25-35溶解于33.3 mL灭菌水配制成150 μmol/L的储备液，过滤后37 ℃恒温孵育7天，-20 ℃保存。将Aβ25-35分成6个浓度组：0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L。取细胞制成细胞悬液，将细胞浓度调整为5×103～1×104个/mL，接种于96孔板，100 μL每孔，8孔每组，细胞接种24 h后基本贴壁用移液枪吸尽个空中的完全培养液，按照分组每孔分别加入180 μL事先配制的不同浓度的Aβ25-35溶液，一次接种3块96孔板，分别在换液后24 h，48 h，72 h进行OD值的检测。

1.4 MTT法细胞活力分析

选取无菌96孔板，96孔培养板内加入5×103～1×104个/mL单细胞悬液，每孔加入180 μL培养液，CO2孵箱中培养24 h并且加入倍比稀释成3种浓度的BYHWD(0.1 mg/L,1 mg/mL,10 mg/mL)各180 μL，孵箱中培养68 h后吸去上清液，每孔中加入MTT 20 μL，继续培养4 h后加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，自动酶标仪测量各孔的吸光度值(A值)。

1.5 bax和caspase9蛋白含量测定

补阳还五汤(0.1、1、10 μg/ml) 加入Aβ诱导的大鼠微血管内皮细胞培养68 h后，收集细胞，用 Western blot 测定细胞中bax和caspase9蛋白的表达量。

1.6 统计分析

所有的实验结果用三次实验平均值±SD计算。统计结果分析使用方差分析，P<0.05差异认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 Aβ剂量确定

如表1所示，小于1 nmol/L的Aβ基本不影响大鼠微血管内皮细胞的活力，大于10 nmol/L的Aβ明显抑制细胞活性。说明自10 nmol开始对大鼠微血管内皮细胞造成损伤，并且随着剂量的增大细胞活力降低，所以我们选择10 nmol/L Aβ为造模浓度。

表1 相对细胞抑制率百分比结果±s)

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2 补阳还五汤对Aβ诱导PMVEC细胞bax蛋白表达的影响

由图1，2可知，Aβ诱导显著上调bax蛋白表达，补阳还五汤高中低剂量(10 mg/L,1 mg/mL,0.1 mg/mL)预处理，三个浓度对bax表达均有显著逆转作用，均有显著性差异(P<0.01)。

图1 补阳还五汤对Aβ诱导PMVEC细胞bax蛋白表达的影响

图2 补阳还五汤对Aβ诱导PMVEC细胞bax蛋白表达的影响注：与空白组相比，#P<0.01;与UVB模型组相比，*P<0.05，**P<0.01

2.3 补阳还五汤对Aβ诱导PMVEC细胞casepase9蛋白表达的影响

由图3，4可知，Aβ诱导显著上调casepase9蛋白表达，浓度补阳还五汤高中低剂量(10 mg/L,1 mg/mL,0.1 mg/mL)预处理，三个浓度对casepase9表达均有显著逆转作用，均有显著性差异(P<0.01)。

图3 补阳还五汤对Aβ诱导PMVEC细胞casepase9蛋白表达的影响

图4 补阳还五汤对Aβ诱导PMVEC细胞casepase9蛋白表达的影响注：与空白组相比，#P<0.01;与UVB模型组相比，*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

Aβ是中枢神经系统中一种重要的兴奋性神经递质，但当其细胞外浓度过高时，可产生兴奋性神经毒性，造成神经元的损伤。前期我们以“β-淀粉样蛋白级联假说”为切入点，采用大鼠单侧海马区定向注射Aβ1-40复制AD动物模型，探讨补阳还五汤对AD模型大鼠的作用及相关机制。研究结果表明，补阳还五汤对Aβ1-40所致AD模型大鼠学习记忆障碍具有明显改善作用[14-16]；可显著地降低AD模型大鼠海马和皮质Aβ沉积，改善Aβ所造成的神经元和微血管损害，减轻脑组织炎性反应；并且可以影响免疫炎性细胞因子及相关基因的表达[15-17]。然而补阳还五汤抗AD的分子调控机制仍有待于深入研究。

细胞凋亡(Apoptosis)是基因调控的自主、有序的死亡过程[18]。目前人们已认识到很多疾病的发生与细胞凋亡密切相关。细胞凋亡分子机制中重要的一条途径为内源性途径， Caspase-9位于此途径级联反应的上游，是凋亡途径中重要起始因子[19]。本研究结果显示，Caspase-9 在Aβ25-35诱导脑微血管内皮细胞损伤表达量明显高于正常组，引起细胞凋亡，而补阳还五汤干预后Caspase-9蛋白表达量降低，说明补阳还五汤具有抑制细胞凋亡作用。

Bax是Bcl-2基因家族中细胞凋亡促进基因[20-21]。本研究结果显示，Bax在Aβ造模的大鼠微血管内皮细胞表达量明显高于正常细胞中的表达量(P<0.05)，提示在微血管内皮细胞损伤导致的老年痴呆发生过程中可能有促凋亡基因 Bax 的参与，补阳还五汤作用大鼠微血管内皮细胞后Bax蛋白表达下调，表明补阳还五汤可有效抑制Aβ诱导的细胞凋亡，从而起到保护的作用。

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Protective Effects of Buyang Huanwu Decoction on Apoptosis ofMicrovascular Endothelial Cells Induced by Aβ in Rats

LIU Bin1,LIU Guo-liang1,ZHANG Ning1,ZHANG Hong2,ZHANG Tao2,DONG Xiao-hong1,ZHOU Zhong-guang1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China；2.JiamusiUniversity，Jiamusi154007，China)

Objective：To investigate the influence of Buyang Huanwu decoction on apoptosis of microvascular endothelial cells induced by Aβin rats. Methods: Establish the damage models of microvascular endothelial cells induced by Aβ and different concentrations of Buyang Huanwu decoction (0.1, 1, 10 ug/ml) were given. Methylthiazolyl tetrazolium (MTT) assay was adopted to measure the viability of microvascular endothelial cells. Western blot method was used to determine the expression of bax and caspase-9 proteins. Results: The expression of bax and caspase-9 proteins of microvascular endothelial cells induced by Aβ were inhibited by Buyang Huanwu decoction (0.1, 1, 10 ug/ml) in a concentration-dependent manner. Conclusion: Buyang Huanwu decoction can inhibit the expression of bax and caspase-9 proteins and it has a protective effect on microvascular endothelial cells in rats, which may be an effective therapeutic agent for cardiovascular system diseases.

Buyang Huanwu decoction; Bax；Caspase9；Microvascular endothelial cells in rats

2016-10-12

2016-12-10

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12541758)

刘斌(1970-)，男，副教授，博士研究生，主要从事中医药防治老年性痴呆及其抗肿瘤的研究工作。

*通讯作者：张涛(1971-)，女，博士，教授，硕士研究生导师，主要从事肿瘤免疫机制及中药抗肿瘤研究。

R285.5;R289.56

A

1002-2392(2017)02-0077-03