脑皮质撞击法致创伤性脑损伤大鼠模型的构建

付 浩，孙中磊，杨小飒，闫海洋，孙圣凯，陈孝储，陈旭义，王志宏

(1.武警后勤学院附属医院 脑科医院，天津 300162；2.锦州医科大学 研究生学院，辽宁 锦州 121300；3.天津市神经创伤修复重点实验室，天津 300162)

基础医学研究

脑皮质撞击法致创伤性脑损伤大鼠模型的构建

付 浩1,3，孙中磊2,3，杨小飒1,3，闫海洋1,3，孙圣凯1，陈孝储1，陈旭义1,3，王志宏1

(1.武警后勤学院附属医院 脑科医院，天津 300162；2.锦州医科大学 研究生学院，辽宁 锦州 121300；3.天津市神经创伤修复重点实验室，天津 300162)

目的 通过脑皮质撞击法构建不同损伤程度创伤性脑损伤大鼠模型，以探讨脑皮质撞击仪参数的选取，为创伤性脑损伤的研究提供实验基础。方法 雌性SD大鼠48只，随机等分为6组：即T1模型组、T2模型组、T3模型组、T4模型组、T5模型组(打击深度分别为1、2、3、4、5 mm)和正常对照组。模型组应用皮质和打击仪，通过设定共同的打击速率(5 m/s)、共同的打击最低点持续时间(200 ms)和不同的打击深度，造成不同程度的创伤性脑损伤，对照组不进行任何操作。术后24 h进行神经功能损伤评分(mNSS)、网屏实验评分和旷场试验评分。结果 各TBI模型组的mNSS评分与对照组比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)，随着打击深度的增加，评分依次增高，但T1组与T2组差异无统计学意义(P<0.05)；T2组、T3组、T4组和T5组的网屏实验评分与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；旷场试验中，各TBI模型组仅T3组垂直得分与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。水平得分和大便粒数两项指标，各组差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 以5 m/s为打击速率，200 ms为打击最低点持续时间，打击深度分别为1、3、4 mm可有效构建模拟轻、中、重度创伤性脑损伤的大鼠模型。

创伤性脑损伤；脑皮质撞击法；动物模型；改良神经功能损伤评分;SD大鼠

创伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury，TBI)是一种破坏性极大的中枢神经系统损伤，全世界每年有大约1 000万人因创伤性脑损伤住院治疗或死亡[1]，给各国带来了较为沉重的经济和社会负担。因此构建与临床类似的不同损伤程度的动物模型，对于TBI的相关机制和诊疗研究尤为重要。目前，脑皮质撞击仪致伤法是一种较为常用的造模方法，但具体打击参数尚无统一标准，且国内鲜有报道。本研究拟利用脑皮质撞击仪构建不同损伤程度TBI大鼠模型，为相关参数的选取提供更多基础研究。

1 材料与方法

1.1 一般资料 取7～8周龄雌性SD大鼠48只(购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心)，体质量220～250 g。实验开始前均适应性喂养1周，自由饮食、饮水。按处理方式随机分为6组：即T1模型组、T2模型组、T3模型组、T4模型组、T5模型组和正常对照组，每组8只大鼠。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备 模型制备术前1 h，各模型组腹腔注射青霉素10万单位。采用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)将各模型组大鼠麻醉。暴露右侧顶骨，用手术刀片刮净颅骨表面软组织。颅钻钻孔(直径约4.5 mm)，进行打击前准备。将电子脑皮质撞击仪(eCCI，美国Custom&Design公司)打击臂调整至与垂直方向呈20 °夹角，使打击面与脑皮质基本平行。应用3 mm打击帽精确打击各组大鼠大脑皮层。打击共同参数如下：打击速率(velocity)为5 m/s ，打击最低点持续时间(dwell)为200 ms。T1-5模型组的打击深度(depth)分别为1、2、3、4、5 mm。打击完成后用沾过生理盐水的棉签止血，缝合皮肤。正常对照组则不进行任何操作。造模后24 h由经过培训且不知分组情况的实验员进行相关评分实验评分。

1.2.2 改良神经功能损伤程度评分(mNSS) 按照Chen等[2]的方法，分数越高表明神经功能损伤症状越严重，正常为0分，损伤最严重为18分。

1.2.3 网屏实验 将网屏水平放置，下方铺以12 cm厚的海绵。网屏各参数如下：网屏为50 cm×50 cm网带，网眼为1 cm×1 cm，网屏距地面高度约80 cm。将大鼠放在网屏上，以网屏一边为轴，转动135 °。观察各组大鼠在网屏上的停留时间，进而评价前爪抓握能力及肌力情况。评分标准分为5个等级，即0分：在网屏上停留达20 s以上，未跌落；1分：在网屏上停留16～20 s；2分：在网屏上停留11～15 s；3分：在网屏上停留达6～10 s；4分：在网屏上停留0～5 s。

1.2.4 旷场实验 于安静环境中依次将各组大鼠自尾根部1/3处提起，轻轻放入自制矿场试验箱正中央的方格内。实验箱参数如下：敞箱为正方形，长、宽各80 cm，高40 cm；底面由面积相等、边长16 cm的25块正方形组成。观察各组大鼠3 min内在陌生环境中的行为。包括水平得分：记录大鼠水平穿越的格子数，以3只或4只爪子跨入1格记为1分，代表自主运动能力；垂直得分：记录大鼠站立次数，双前爪抬离地面超过1 cm以上或者攀附箱壁视为站立，记为1分，代表探索行为能力；粪便粒数：记录大鼠5 min内的粪便粒数，代表紧张程度。每只大鼠完成实验后，须对旷场实验箱进行清洗方可进行下一只大鼠的旷场实验评分。

2 结果

2.1 各组存活情况 T4模型组死亡1只，T5模型组死亡4只，其余各组均成活。

2.2 神经功能损伤评分 各TBI模型组的mNSS评分与对照组比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)，随着打击深度的增加，评分依次增高，但T1组与T2组差异无统计学意义(P>0.05，见图1)。

mNSS为改良神经功能损伤程度评分；*：与对照组比较，P<0.05；#：与其他各组比较，P<0.05。图1 各组大鼠神经功能损伤评分比较

2.3 网屏实验 T2组、T3组、T4组和T5组的网屏实验评分与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；T1组与对照组比较，网屏实验评分有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05，见图2)。

*：与对照组比较，P<0.05图2 各组大鼠网屏实验评分比较

2.4 旷场试验 各TBI模型组中，仅T3组与对照组垂直得分比较，差异有统计学意义(P<0.05)。水平得分和大便粒数两项指标，各组差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

组别水平得分垂直得分大便粒数对照47.83±16.4718.83±7.884.67±1.75T137.50±22.7111.50±3.502.67±2.25T236.00±27.2613.00±3.934.67±2.94T354.80±10.306.67±2.80*2.60±1.67T431.16±20.5613.14±4.604.71±2.29T535.50±17.7112.00±4.324.00±2.31

*：与对照组比较，P<0.05。

3 讨论

目前常用的TBI动物模型构建方法主要有自由落体法、爆炸致伤法、液压冲击法和脑皮质撞击法[3]。其中自由落体法最为简单易行，但重复性低，致伤程度不确定，且易受多种因素干扰，较难建立一个标准化的操作方法[4-5]；爆炸致伤法多用于爆炸伤研究，应用范围较小[6]；液压冲击法可以精确控制致伤部位和打击方向，并输出精准的冲击压力，但骨窗处需应用骨水泥连接打击帽，每次打击前均需矫正，造模效率较低，且器材昂贵，不易推广[7]；脑皮质撞击法打击力度可精确控制，且不需要应用骨水泥，造模效率高且简单易行，应用广泛，但缺点在于具体打击参数尚未达成共识，这不利于模型的标准化[8]。本实验通过固定打击速率和打击最低点持续时间，改变打击深度，为构建不同损伤程度TBI模型提供了理论依据。

实验结果可见，打击深度1 mm时，大鼠神经功能损伤程度较低，抓握能力和肌力无明显下降，探索行为能力略降低；打击深度2 mm时，神经功能损伤程度与1 mm时无差别，抓握能力和肌力明显下降，探索行为能力降低，但总体来看与T1组区分度不大；打击深度为3 mm时，神经功能损伤程度中等，抓握能力和肌力显著降低，探索行为能力降低；打击深度为4 mm时，神经功能损伤程度较高，抓握能力和肌力显著降低，探索行为能力进一步降低；打击深度为5 mm时，虽然损伤症状最为严重，但造模死亡率显著升高，表明该参数过大，并不适合应用于模型的构建。上述结果表明，脑皮质撞击法可稳定构建大鼠TBI模型，且利用打击深度的不同对损伤进行分级，效果明显；选取打击深度1、3和4 mm或可分别模拟轻度、中度和重度TBI。旷场实验是评价创伤后应激障碍的重要方法之一，应激障碍的发生与创伤程度密切相关[9-10]。但本实验中，精神症状差别不显著，可能由于创伤后精神症状需要较长时间才能出现，24 h内尚不能发生显著改变。因此在评价短期造模效果时，或许不宜再进行旷场实验。

综上所述，本实验通过固定打击速率和打击最低点持续时间，改变打击深度，成功构建了不同损伤程度TBI模型，为打击参数的选取及模型构建的评价提供了更多的理论依据。

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[收稿2016-11-29;修回2016-12-22]

(编辑：王静)

The establishment of traumatic brain injury rat model by cerebral cortex impact method

FuHao1,3,SunZhonglei2,3,YangXiaosa1,3,YanHaiyang1，3,SunShengkai1,ChenXiaochu1,ChenXuyi1,3,WangZhihong1

(1.Brain Hospital of Affiliated Hospital of Logistics College of PAP, Tianjin 300162, China; 2.Graduate School,Jinzhou Medical University, Jinzhou Liaoning 121300, China; 3.Tianjin Key Laboratory of Neurotrauma Repair, Tianjin 300162, China)

Objective To explore the best parameter of controlled cortical impactor，in order to establish traumatic brain injury rat model with different severity for further TBI study.Methods 48 female SD rats were randomly divided into T1 group, T2 group, T3 group, T4 group, T5 group (the striking depth were 1,2,3,4 and 5 mm, respectively) and control group equally. TBI group were conducted by controlled cortical impact injury technics with the same striking velocity (5 m/s), the same dwell at the bottom (200 ms) and different striking depth, so as to make different severity of TBI. No operation was carried out in control group. At 24 h after operation, neurological function was evaluated according to modified neurological severity score (mNSS), screen test and open field test.Results The mNSS of TBI group was significantly higher than control group, and the more severe the TBI was, the higher mNSS (allP<0.05), but the difference between T1 and T2 group was not statistically significance (P>0.05). The screen test score of T2, T3, T4, and T5 group were different from control group (P<0.05). In the open field test, only the horizontal score of T3 group was significantly different from control group (P<0.05), there was no significant difference (P>0.05) among the six groups in vertical score and stool grain number.Conclusion Different severity TBI rat model can be established by cerebral cortex impactor with the same striking velocity (5 m/s), the same dwell at the bottom (200 ms) and different striking depth (1,3,4 mm), which can represent light TBI, moderate TBI and severe TBI.

traumatic brain injury (TBI); controlled cortical impact injury (CCI); animal model; modified neurological severity score (mNSS);SD rats

国家自然科学基金资助项目(NO：11672332)；天津市卫生局科技基金资助项目(NO：2015KZ126)；天津市卫生和计划生育委员会中医中西医结合科研课题(NO：2015155)；天津市神经创伤修复重点实验室开放基金(NO：WYKFZ201602)；武装警察部队后勤学院基础研究项目(NO：WHJ2015013)；武装警察部队后勤学院附属医院种子基金(NO：FYM201517、FYQ201560)。

王志宏，男，硕士，主任医师，研究方向：老年医学，E-mail:yjb_office@126.com。

R651

A

1000-2715(2017)01-0038-04