益母草愈伤组织诱导与生物转化能力初探

唐婕妤，罗月芳，龙靖娴，彭菲*

(1.湖南中医药大学生物工程实验室，中药鉴定与资源实验室, 湖南 长沙 410208;2.广西师范大学药用资源化学与药物分子工程重点实验室, 广西 桂林 541004)

中 药 研 究

益母草愈伤组织诱导与生物转化能力初探

唐婕妤1，罗月芳1，龙靖娴2，彭菲1*

(1.湖南中医药大学生物工程实验室，中药鉴定与资源实验室, 湖南 长沙 410208;2.广西师范大学药用资源化学与药物分子工程重点实验室, 广西 桂林 541004)

目的:建立益母草愈伤组织培养体系，用于生物转化外源底物初探。方法:以MS为基本培养基，研究不同外植体及植物生长调节剂对益母草愈伤组织诱导及增殖的影响，并对获得的愈伤组织生物转化能力进行初探。结果:益母草子叶诱导率85.79%、真叶诱导率97.88%、下胚轴诱导率29.78%；诱导的最适配方为MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L；初期增殖最适配方为MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L；长期继代最适配方为MS+2,4-D 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L；最佳继代周期10 d；获得的3种愈伤组织悬浮培养均具有转化外源氢醌生成熊果苷的能力。结论:益母草愈伤组织经优选增殖，有望成为转化外源物质的良好材料。

益母草；愈伤组织；生物转化；氢醌；熊果苷；糖基化

生物转化是指将与目标成分结构相似的物质投料，通过生物体系(酶的作用)转化为所需的天然活性成分，属于国际上倡导的“绿色化工”。益母草(LeonurusjaponicusHoutt.)为常用药用植物，其次生代谢发达[1]，酶系丰富，且生长速度快，细胞分裂周期短，适宜作为生物转化的良好材料。熊果苷(Arbutin)是一种天然存在的糖苷类物质，为常用美白成分，并具有抗溃疡[2]、抗肿瘤[3]、抑制胰岛素降解[4]、镇咳[5]等多种药理作用，可通过外源氢醌糖基化而获得[6]。因此，本课题组以益母草为材料，对其愈伤组织诱导、继代条件做了优化，并初步探索了益母草愈伤组织转化外源氢醌生成熊果苷的能力，为开发利用益母草悬浮细胞转化外源物质打下基础。

1 材料

益母草(LeonurusjaponicusHoutt.)种子由湖南中医药大学彭菲教授采集于湖南省长沙市跳马乡。β-熊果苷标准品购自中国食品药品检定研究院，纯度>99.7%，批号:111951-201301。

2 方法

2.1 益母草愈伤组织诱导

诱导培养基：以 MS 为基本培养基；将植物生长调节剂 2,4-D、6-BA和NAA 配比(见表1)；蔗糖30 g/L；琼脂7 g/L；pH值5.8；121 ℃、0.1 Kpa下灭菌20 min。

外植体接种及培养：将益母草种子发芽生长至四叶期，剪去根，75%酒精浸泡30 s，无菌水洗净，0.1%升汞灭菌10 min。将小苗下胚轴、子叶和真叶分别切成长度为0.5 cm左右的小段，接入各诱导培养基中，在25 ℃、光照强度1500 lx、光照时长12 h/d下培养。跟踪记录诱导情况，第25 d时统计观察结果。

愈伤组织诱导率=产生愈伤组织的外植体数/接入外植体数

2.2 益母草愈伤组织继代增殖与纯化

根据益母草愈伤组织诱导实验结果，设计愈伤组织增殖培养基。以 MS为基本培养基；配比不同植物生长调节剂(表2)。

将诱导得到的愈伤组织切成0.3 cm×0.3 cm小块，分别接入不同的增殖培养基中培养，以筛选益母草愈伤组织增殖培养基。选择色泽一致、质地均一、疏松有砂粒感的小愈伤组织继代在筛选出的培养基上增殖，待其生长量增殖达6倍左右时，再继代。经多次继代后获得纯化的愈伤组织，将纯化好的疏松愈伤组织以2 g/瓶接种于50 mL锥形瓶，置于光照强度1 500 lx、时长12 h/d及全黑条件下培养，绘制其生长曲线。

2.3 益母草愈伤组织转化氢醌生成熊果苷能力初探

将获得的纯化愈伤组织分别取5 g下悬浮，使用250 mL摇瓶，装液量100 mL，转速110 r/min，光照12 h/d。在悬浮培养液中添加2 mmol/L氢醌培养12 h后，收获细胞，过300目筛网滤去培养液，用蒸馏水将收获的细胞清洗3遍，50% 甲醇20 mL超声提取40 min(功率200 W，频率40 kHz)，过0.45 μm滤膜，进样HPLC分析生成熊果苷的含量。

3 结果与分析

3.1 益母草愈伤组织的诱导

3.1.1 植物生长调节剂对益母草愈伤组织诱导的影响

益母草愈伤组织诱导结果见表1。在诱导早期，配方一、六诱导速度较快，质地疏松，随着培养时间增加，配方六水渍渐多，愈伤组织软散无结构。对比不同生长素(即配方一、二对比配方七、八)，NAA所诱导愈伤组织显微观察细胞形态近似圆形，2,4-D所诱导愈伤组织细胞形态复杂多样；同时NAA诱导愈伤组织产色素，其愈伤组织致密有疣状突起，并且诱导不定根与不定芽。固定细胞分裂素，随着生长素比例的增加(即配方一、二、三)，愈伤组织水渍逐渐增多，软散无结构。对比细胞分裂素不同水平(即配方一、二、三分别对比配方四、五、六)，细胞分裂素水平较低时，愈伤组织生长量较少，水渍较多。综上，配方一(MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L)适合作为益母草愈伤组织诱导配方。

表1 植物生长调节剂对益母草愈伤组织诱导的影响

注：生长量,+为一般，++为较多，+++为很多

3.1.2 最佳外植体的筛选

真叶第3天整体退绿皱缩，愈伤组织从叶面一簇一簇生长，团块较大，表面粗糙有颗粒感，诱导率97.88%；下胚轴第7天从中端内部开始膨胀，诱导的愈伤组织疏松有沙粒感，略带水渍，诱导率29.78%；子叶第9天整体退绿，从切口处开始膨大，愈伤组织团块小，疏松，表面有针状感，诱导率85.79%。显微观察真叶、子叶、下胚轴所诱导的愈伤组织细胞形态差异不明显。综上，真叶诱导率最高，下胚轴诱导的愈伤组织最疏松。

3.2 益母草愈伤组织的继代

3.2.1 益母草愈伤组织继代增殖与纯化

在早期继代配方筛选中，生长量：配方一>配方五>配方六>配方九，因此高细胞分裂素，低生长素适合益母草愈伤组织早期增殖，选取配方一(MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L)作为益母草愈伤组织的早期增殖配方。

随着继代次数的增多，反复继代增殖6个月时，愈伤组织活性下降，此时对继代增殖配方进行再优化(见表2)。配方十不添加植物生长调节剂，愈伤组织不生长，逐渐死亡；配方七生长素为NAA，诱导愈伤组织产色素；配方十一生长量最多。综上，在益母草愈伤组织长期继代中，适当降低植物生长调节剂有益于愈伤组织的增殖，选取配方十一(MS+2,4-D 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L)作为愈伤组织的长期继代配方。

益母草愈伤组织继代纯化后得到三种不同颜色的愈伤组织(见图1)。白色愈伤组织蓬松有砂粒感，生长速度快，显微下能观察到白色体，质地有海绵感，初下悬浮会漂浮在培养液上，后吸培养液下沉；绿色愈伤组织略带水渍，显微下能观察到叶绿体，在培养液中易分散开来，均一度好，生长速度较快；紫色愈伤组织，生长速度慢，显微下能观察到有色体，下悬浮后，培养液颜色变深。

表2 植物生长调节剂对益母草愈伤组织增殖的影响

注：生长量,+为一般，++为较多，+++为很多

图1 益母草纯化出的3种愈伤组织

3.2.2 益母草愈伤组织增殖的生长曲线

纯化的益母草绿色疏松愈伤组织其生长曲线见图2。如图所示，光暗交替下愈伤组织生长量大于全黑培养条件；第10 d时生长速度最快，为最佳继代时间；整个生长周期中，16 d时生长量最多，增殖倍数达8倍左右。

图2 益母草愈伤组织生长曲线

3.3 益母草愈伤组织转化氢醌生成熊果苷

3.3.1 色谱条件

3.3.1.1 熊果苷最佳吸收波长确定

选用Ultimate XB-C18(HS)色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)进样熊果苷标准品，经Agilent1260二极管阵列(DAD)检测，得到熊果苷最大吸收波长为285 nm。

3.3.1.2 流动相考察

分别考察了甲醇与水的不同比例，甲醇：水=20:80时，标准品峰拖尾；甲醇：水=10:90时，标准品峰的对称因子偏低；选取甲醇：水=5:95作为分析待测物的流动相。

3.3.2 方法学考察(另见报道)

3.3.3 样品测定

将获得的3种纯化愈伤组织分别取5 g下悬浮，按方法2.3测定熊果苷含量。经HPLC分析，结果显示，益母草3种愈伤组织均能将外源氢醌转化为熊果苷(见图3)。产量分别为白色0.73 mg/g；绿色0.87 mg/g；紫色0.54 mg/g；绿色愈伤组织转化能力最强。(见图4)。

图3 益母草愈伤组织转化氢醌生成熊果苷HPLC图A为经转化处理的益母草愈伤组织提取液；B未经转化处理的益母草愈伤组织提取液;C为熊果苷标准品；D为氢醌标准品

图4 益母草3种愈伤组织生物转化氢醌生成熊果苷的能力

4 小结与讨论

益母草为喜光草本植物，在光照条件下愈伤组织诱导和增殖速度快，最佳继代时间为10 d，真叶诱导率高，下胚轴诱导出的愈伤组织疏松有砂粒感。2,4-D启动植物细胞脱分化效果好，细胞分裂素能使脱分化的细胞保持持续的有丝分裂，当两者用量比为1∶4时，外植体脱分化快，愈伤组织生长量多，质地疏松，且能

保持持续的细胞增殖，因此选取MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L作为诱导和继代增殖配方，此优选配方与林群超[7]报道的益母草真叶诱导配方一致；愈伤组织经过长期反复继代，细胞活性下降，推测与细胞内部生长调节剂积累浓度过高有关，此时适当降低植物生长调节剂浓度效果更好，因此优选出MS+2,4-D 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L作为长期继代配方。

NAA诱导愈伤组织时会产生少量不定根与不定芽，然而显微下观察其所诱导愈伤组织细胞形态更好，近似圆形；在继代时添加NAA，愈伤组织会变得更绿，说明NAA对益母草愈伤组织中叶绿体的产生有促进作用。叶绿体的出现表明愈伤组织已出现分化，原则上不是最适宜继代纯化的愈伤组织类型，而在益母草愈伤组织转化氢醌生成熊果苷时，来源于绿色愈伤组织的细胞转化率最高。分析原因，氢醌转化生成熊果苷属于糖基化过程，而叶绿体通过卡尔文循环生成磷酸丙糖，经一系列酶催化，生成熊果苷合成途径上的糖基供体UDPG，因而分化出叶绿体的愈伤组织转化熊果苷的能力更强。优选出的愈伤组织总体转化能力还较低，在后期研究中需筛选出高转化率的细胞株，建立良好的悬浮系，并对悬浮细胞培养条件及转化条件进行优化。

[1] 周勤梅.益母草的化学成分研究[D].成都:成都中医药大学,2014.

[2] Lee HJ,Kim KW.Anti-inflammatory effects of arbutin in lipopolysaccharide-stimulated BV2 microglial cells[J].Inflamm Res,2012,61(8):817-825.

[3] Li H,Jeong YM,Kim SY,et al.Arbutin inhibits TCCSUP human bladder cancer cell proliferation viaup-regulation of p21[J].Pharmazie,2011,66(4):306-309.

[4] 姜洪君,郭凤根,张丽梅,等.滇产岩白菜中熊果苷含量的比较[J].中国中药杂志,2010,35(14):1812-1814.

[5] 王亚芳,周宇辉,张建军.熊果苷镇咳、祛痰及平喘的药效学研究[J].中草药, 2003,34(8):70-72.

[6] 唐婕妤,彭菲.熊果苷的药理作用与资源获取途径研究进展[J].今日药学,2015,25(9):673-677.

[7] 林超群,杨晖,赵鹂.影响益母草愈伤组织诱导的因素[J].安徽农业科学,2010,38(22):11769-11770.

Callus Induction and Biotransformation Ability of Leonurus Japonicus

TANG Jie-yu1, LUO Yue-fang1, LONG Jing-xian2, PENG Fei1

(1.BiologicalEngineeringLabofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China;2.StateKeyLaboratoryCultivationBasefortheChemistryandMolecularEngineeringofMedicinalResources,SchoolofChemistryandPharmacy,GuangxiNormalUniversity,Guilin541004,China)

Objective: To establish the callus culture system of Leonurus japonicus, which was used in bioconversion exogenous substrates. Methods: MS was selected as the basic medium, and the effects were detected according to callus induction and proliferation with different explants and plant growth regulators, and then the callus ability of bioconversion was explored. Results: The callus induction rate of cotyledon was 85.79%; the induction rate of true leaf was 97.88%; the induction rate of hypocotyl was 29.78%. The optimum medium formula for inducing callus was MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L; that for initial proliferation was MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 2 mg/L; that for callus Long-term successive transfer culture was MS+2,4-D 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L; the optimal cycle of subculture was 10 d; the three kinds of callus in suspension culture had the ability of hydroquinone into arbutin. Conclusion: By optimizing proliferation ,the callus of Leonurus japonicus is expected to become a good material for transformation exogenous compounds.

Leonurus japonicas; Callus; Biotransformation; Hydroquinone; Arbutin; Glycosylation

2016-05-02

2016-11-20

湖南省科技厅社会发展支撑计划项目(2013SK3081)

唐婕妤(1992-)，女，硕士研究生，主要从事药用活性成分的生物合成及其调控。

*通讯作者：彭菲(1963-)，女，教授，主要从事中药生物工程研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0050-04