养血行血方抗大鼠实验性外伤性视神经损伤的形态学观察

肖家翔，文婷，姚莹

养血行血方抗大鼠实验性外伤性视神经损伤的形态学观察

肖家翔，文婷，姚莹

目的观察养血行血方对实验性外伤性视神经损伤的保护作用。方法将实验SD大鼠60只随机抽取15只为空白对照组，其余45只造模后随机分为模型对照组、生理盐水组及中药治疗组，每组15只。空白对照组及模型对照组造模24小时后，生理盐水组及中药治疗组（养血行血方）用药4周后取左眼观察视网膜视神经的形态变化。结果大鼠造模后大量RGC肿胀变形，胞核肿胀明显，神经纤维层显著水肿；生理盐水组大量RGC胞体变形，呈空泡样变性脱落，数量显著减少，核皱缩，神经纤维层显著变薄；而中药治疗组只有少量RGC轻度肿胀，少量变性，数量略减少，胞核可见，神经纤维层轻度变薄。结论养血行血方能抗RGC损伤，降低其凋亡，促进视神经纤维的修复而保护视神经。

养血行血方；视神经/外伤；疾病模型；动物

视神经萎缩（optic atrophy，OA）是视网膜神经节细胞（RGC）及其轴突、视神经纤维由于各种原因受损害的结果，是眼科主要致盲性眼病之一[1-2]。本病以外伤性、炎症性居多[3]。外伤性视神经损伤导致的视神经萎缩的研究既往主要集中在解除视神经受压方面，而“神经保护”未得到足够的重视。临床上相当多的患者在视神经解压后已存在视功能的损害，表明在视神经受压时需及时对视神经进行保护性治疗，故本研究采用临床治疗视神经萎缩行之有效，以养血行血为法组方制成的双芍护睛散用于实验性外伤性视神经损伤的治疗，通过对视网膜视神经的形态学观察，以验证养血行血方抗视神经损伤的作用，为有效治疗视神经萎缩提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：选用健康3月龄SD大鼠60只，雌雄不限，体重200-250 g，由贵州医科大学动物实验中心提供（合格证号：SCXK（黔）2013-017）。购进大鼠经手持裂隙灯检查双眼角膜透明，虹膜血管清晰，瞳孔对光反射灵敏，晶状体无混浊者纳入实验。将60只大鼠抽取15只为空白对照组，其余45只造模后随机分为模型对照组、生理盐水组及中药治疗组，每组15只。

药物及仪器：双芍护睛散（白芍、赤芍、茺蔚子、桑葚、泽兰、牛膝、鸡血藤、川芎等），按现代中药制剂工艺制成散剂，由贵阳中医学院中药制剂室制备。仪器：瑞典产LKBⅢ型超薄切片机；日本产JEM-1200EX透射电镜。

1.2 方法

参照李云琴[4]的方法进行造模：将需造模的45只大鼠于造模前3 d用0.25%氯霉素滴眼液滴眼，每日3次。造模时以3.5%水合氯醛右下腹腔注射麻醉，并以1%盐酸丙美卡因对大鼠左眼进行表面麻醉。麻醉后，将大鼠固定于动物手术台上，沿左眼颞侧角膜缘将球结膜环形剪开，分离球结膜和巩膜，分离时避开外直肌，然后继续向后分离，打开肌锥后将视神经暴露出来，用视神经钳夹器夹于球后视神经2 mm处，钳夹力相等，30 s后松开钳夹器，用8-0尼龙线缝合球结膜，造模完成后以庆大霉素做球结膜下注射，以0.3%妥布霉素眼膏涂于结膜囊内，然后将大鼠保温至苏醒。观察造模眼的瞳孔情况，以瞳孔直接对光反射消失，间接对光反射存在者作为造模成功的实验动物纳入实验。

给药方法：中药治疗组及生理盐水组造模成功24 h后开始每日给药，剂量参照徐叔云[5]关于人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表拟定，治疗组以双芍护睛散混悬液（每100 ml含散剂30 g）灌胃，剂量为5 ml/Kg·d，2次/d；生理盐水组以等剂量生理盐水灌胃，2次/d。2周为1个疗程，停药2 d后继续第2个疗程，共2个疗程。

标本制作及观察：空白对照组及模型对照组在造模成功24 h后；中药治疗组以及生理盐水组给药2个疗程后采用完全随机法随机抽取各组中的10只大鼠以10%水合氯醛过量腹腔注射处死，取左眼视网膜作光镜观察，重点观察视网膜神经节细胞及神经纤维层的组织结构。各组剩余5只大鼠同法处死后取左眼视网膜作透射电镜观察，主要观察视网膜神经节细胞的超微结构。

光镜标本制作：摘取左眼眼球，置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液（pH7.4）内，4℃固定24 h，去除眼前节，梯度酒精脱水和二甲苯透明后，常规石蜡包埋。将包埋好的眼球标本以平行于视盘矢状位且以其为平面的视网膜进行连续切片，厚约5 μm，置于预先用多聚赖氨酸处理的载玻片上，60℃温箱烤片过夜，HE染色。

电镜标本制作：摘取左眼眼球，在冰上沿角膜缘剪开眼球后，去除晶状体、玻璃体，翻转眼球套在台柱上，用生理盐水由切口边缘向中心冲洗，视网膜即可完整脱落悬在视盘上，用眼科显微镊夹取视网膜，取包含视盘的一段约2 mm×2 mm的全层视网膜，立即放于2.5%的戊二醛溶液中固定1 h，磷酸盐缓冲液冲洗2 h，用1%锇酸固定2 h，系列乙醇脱水，Epon环氧树脂812包埋，聚合35℃、40℃、55℃各12 h，半薄切片（1 μm）光学定位，以超薄切片机切片（70 nm），醋酸双氧铀枸橼酸铅染色。

2 结果

2.1 光镜下各组大鼠视网膜的组织结构

光镜下空白对照组视网膜各层结构形态及排列分布正常，界限清楚。RGC排列整齐，胞浆均质丰富，神经纤维层结构清晰（图1A）。模型对照组视网膜组织结构可见，大量RGC肿胀，排列不规则，神经纤维层显著水肿（图1B）。生理盐水组视网膜组织结构轻度异常，大量RGC明显肿胀、空泡样变性、脱落，排列不规则，数量显著减少，神经纤维层显著变薄（图1C）。中药治疗组视网膜组织结构基本正常，可见少量RGC轻度肿胀，数量略减少，神经纤维层轻度变薄（图1D）。

2.2 电镜下各组大鼠视网膜神经节细胞的超微结构

电镜下空白对照组RGC胞体呈卵圆形，见较长的突起，轮廓清晰，核仁明显，染色质均，核膜清晰，胞浆均匀，可见散在粗面内质网，线粒体丰富（图2A）。模型对照组RGC胞体变形，细胞核肿胀明显，核周间隙增大，线粒体肿胀（图2B）。生理盐水组RGC胞体变形，核皱缩，染色质边聚，线粒体空泡化，微丝数量减少（图2C）。中药治疗组可见少量RGC变性，细胞核可见，细胞染色质轻度不均，线粒体轻度肿胀，微丝数量略减少（图2D）。

图1 视网膜光镜照片（HE染色×400）。图1A为空白对照组，视网膜RGC排列整齐，边界清楚，神经纤维层结构清晰。图1B为模型对照组，视网膜RGC肿胀，神经纤维层显著水肿。图1C为生理盐水组，视网膜大量RGC明显肿胀，变性脱落，数量显著减少，神经纤维层显著变薄。图1D为中药治疗组，视网膜少量RGC轻度肿胀，数量略减少，神经纤维层轻度变薄。

图2 视网膜透射电镜照片（醋酸双氧铀枸橼酸铅染色×20000）。图2A为空白对照组，RGC胞体可见较长的突起，细胞核明显，核膜清晰，染色均匀，线粒体丰富；图2B为模型对照组，RGC胞体变形，细胞核肿胀明显，线粒体肿胀；图2C为生理盐水组，RGC胞体变形，核皱缩，染色质边聚，线粒体空泡化；图2D为中药治疗组，少量RGC变性，细胞核可见，线粒体轻度肿胀。

3 讨论

视神经萎缩不是一种单纯的眼科疾病，是各种病因累及RGC及其轴突等损害后造成视神经纤维变性丧失的最终结局。当视神经受损时，神经纤维会出现部分变细或者全部变细的形态学改变。外伤性视神经损伤引起视功能损害主要为视神经血流灌注不良而缺血，导致RGC细胞凋亡，轴突数量减少，视神经轴索运输受阻，导致神经纤维受损，甚至萎缩。

视神经萎缩一度被认为是视神经严重损伤的最终结局，近年的研究改变了这种认识，有研究显示采用适当而积极治疗对视神经萎缩的视功能可以起到一定的改善作用，并提出了残余视觉激活理论[6]。对视神经萎缩的治疗，中西医均进行了较为广泛的探索。相关实验证明[7]，受损的轴突在某些条件下，可得到一定程度的修复，从而促进神经纤维的再生。孔祥梅等[8]通过实验观察了甲钴胺治疗视神经钳夹伤后SD大鼠，光镜和电镜下可见视神经轴突和RGC异形改变明显减少，能有效减少视神经的退变及丧失。郑幼平等[9]用银杏内脂B对视神经钳夹伤后大鼠进行腹腔注射，结果显示其能有效改善视神经钳夹伤后RGC存活数量和存活时间，具有一定的视神经保护作用。徐朝伟等[10]以明目复元汤联合中药穴位贴敷治疗急性视神经萎缩，结果显示显效及总有效率优于口服肌苷片、腺苷钴胺片及维生素B12者。

由于治疗视神经萎缩目前尚无确切有效疗法，本研究以中医理论为基础，结合现代对外伤性视神经损伤的认识，即主要为视神经血流灌注不良而缺血，导致视网膜神经节细胞凋亡引发视神经萎缩的发病机制，提出目络瘀阻，目系（指视神经及其周围血管组织）失养的立法依据。针对外伤性视神经损伤有“血亏滞”的关键环节，采用治血一要养，二要行的指导原则。故本研究选用临床有效治疗视神经萎缩，以养血行血为法组成的双芍护睛方制成散剂，用于实验性外伤性视神经损伤模型，通过对视网膜神经组织形态学观察以证实养血行血方对外伤性视神经损伤的作用。研究结果显示，大鼠造模后大量RGC肿胀变形，胞核肿胀明显，线粒体肿胀，神经纤维层显著水肿；应用生理盐水者大量RGC胞体变形，呈空泡样变性脱落，数量显著减少，核皱缩，神经纤维层显著变薄；而中药治疗组只有少量轻度肿胀，少量变性，数量略减少，细胞核可见，线粒体轻度肿胀，神经纤维层轻度变薄。提示养血行血方有抗RGC损伤，降低其凋亡，促进视神经纤维修复从而保护视神经的作用。本研究的不足之处是只作了定性观察，未作视网膜神经节细胞数目等量化指标方面的检测，希望在以后的实验中能同时进行定性和定量的观察。

[1]张晓君.进一步提高视神经萎缩的诊断水平[J].眼科，2011，20（6）：364-366.

[2]Dahlmann-Noor A H，Vijay S，Limb G A，et al.Strategies for optic nerve rescue and regeneration in glaucoma and other optic neuropathies[J].Drug discovery today，2010，15（7）：287-299.

[3]滕克禹，吕丽萍.视神经萎缩病因分析[J].中国中医眼科杂志，2013，23（6）：428-430.

[4]李云琴.大鼠外伤性视神经损伤模型的建立[J].眼科新进展，2011，31（10）：934-936.

[5]徐叔云.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2010：302-303.

[6]魏世辉，张秀兰.正确认识视神经萎缩的治疗价值[J].中华眼科杂志，2012，48（12）：1057-1058.

[7]张世杰，王传富，孙为荣，等.视神经挫伤轴浆运输和超微结构变化的实验研究[J].眼科研究，2003，21（6）：585-587.

[8]孔祥梅，孙兴怀.甲钴胺对钳夹大鼠视神经的保护作用[J].眼视光学杂志，2004，9（6）：157-164.

[9]郑幼平，吴小桃，田原，等.银杏内酯B对视神经钳夹伤后大鼠视网膜神经节细胞的保护作用[J].中国医学创新，2015，7（12）：13-15.

[10]徐朝伟，潘小玲.明目复元汤联合中药穴位贴敷治疗急性视神经萎缩的临床观察[J].中国中医急症，2016，25（2）：309-311.

Morphological observation on experimental traumatic optic nerve injury managed by blood-nourishing and circulation-boosting formula

XIAO Jiaxiang，WEN Ting，YAO Ying.
Guizhou Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550001，China

OBJECTIVE To observe the morphological changes of protecting effect of blood-nourishing and circulation-boosting formula on experimental traumatic optic nerve injury.METHODS Sixty experimental SD rats were used in this study，and they were randomly and evenly divided into blank control group，model control group，saline group and TCM treatment group（15 cases，30 eyes in each group）.Observed the morphological change of optic nerve tissue in blank control group and the model control group 24 hours after modeling.While changes in the other two groups were observed 4 weeks after administration of saline and blood-nourishing and circulation-boosting formula respectively using left eye tissue.RESULTS After modeling，a large number of retinal ganglion cells（RGC）were in swollen，nuclei were swollen obviously and nerve fiber layers were in edema.In saline group，large scale of RGC deformed in vacuolar degeneration and decrease in the number，nuclear shrunk and nerve fiber layer thinned markedly；while in TCM treatment group，there was only a small amount of slight swelling RGC，mild degeneration，slight decrease in number and the nuclei were intact，nerve fiber layers were mildly thin.CONCLUSIONS The blood-nourishing and circulation-boosting formula prevented RGC from experimental injury，inhibited its apoptosis，and preserved optical nerve through promoting the retinal ganglion cells repairment.

blood-nourishing and circulation-boosting formula；optic nerve/injury；model of disease；animal

R285.5；R779.1

A

1002-4379（2017）01-0011-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.01.003

贵州省社发攻关项目（20123087）

贵阳中医学院第一附属医院，贵阳550001

肖家翔，E-mail：kate-show@163.com