压力超负荷大鼠心肌胶原代谢的动态变化*

吕仕超， 张军平△， 李 萌， 吴美芳， 王 强， 王晓景， 徐 玲

(天津中医药大学 1第一附属医院老年病科， 2研究生院，天津 300193)

压力超负荷大鼠心肌胶原代谢的动态变化*

吕仕超1， 张军平1△， 李 萌2， 吴美芳2， 王 强2， 王晓景2， 徐 玲2

(天津中医药大学1第一附属医院老年病科，2研究生院，天津 300193)

目的： 探讨压力超负荷大鼠心肌胶原代谢的动态变化。方法: 采用腹主动脉缩窄法制备压力超负荷大鼠模型，并以假手术组为对照，分别于术后第3周、4周、8周和12周取材，称量大鼠体质量、心脏质量和左心室质量，计算心脏质量指数(heart mass index，HMI)和左心室质量指数(left ventricle mass index，LVMI)；心肌组织Masson染色观察心肌胶原纤维沉积情况；样本碱水解法检测心肌组织羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量；ELISA法检测血清Ⅰ型前胶原羧基端肽(procollagen typeⅠcarboxy-terminal peptide，PⅠCP)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(procollagen typeⅢ amino-terminal peptide，PⅢNT)和Ⅰ型胶原C端肽(collagen C telopeptide typeⅠ，CTX-Ⅰ)水平。结果: 与假手术组相比，模型组大鼠心肌血管周围及间质可见胶原纤维沉积，心肌胶原容积分数明显增高(P<0.01)，且随时间延长胶原沉积明显增多；模型组大鼠HMI、LVMI和HYP均明显增加(P<0.05)，且随时间延长大鼠HYP有升高的趋势；模型组大鼠血清PⅠCP浓度显著升高，在第4、8和12周时差异有统计学意义(P<0.05)；模型组大鼠血清PⅢNP浓度显著升高，CTX-Ⅰ浓度显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。结论: 压力超负荷状态下，心肌胶原代谢紊乱，且随时间的延长心肌呈不同程度的纤维化表现。

腹主动脉缩窄； 压力超负荷； 心肌胶原； 心肌纤维化

高血压病是临床最常见的慢性非传染性疾病，其发病率、致残率和死亡率居高不下，虽然高血压的知晓率、治疗率和控制率呈上升趋势，但依旧处于较低水平[1]。我国高血压病患者约2.7亿，经常伴随着心、脑、肾、血管、眼底等靶器官损伤，其中高血压左室肥厚的患病率为20%～30%[2]。高血压左室肥厚是心力衰竭、心律失常、心源性猝死等心血管事件的独立危险因素，其核心病理改变是心肌纤维化。长期的压力超负荷导致心肌胶原纤维过量沉积，胶原浓度显著增加，各型胶原比例失调及排列紊乱，引起心脏功能和结构的改变，从而使得心血管事件的发生率增高。因此，预防/逆转高血压左室肥厚已成为心血管疾病领域研究的热点问题之一。

材 料 和 方 法

1 实验动物

雄性Wistar大鼠，购自军事医学科学院实验动物中心，许可证号为SCXK(军)2012-0004，SPF级，体重180～200 g。

2 主要试剂

戊巴比妥钠和Masson三色染色液购自天津百浩生物科技有限公司；羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)测试盒购自南京建成生物工程研究所；大鼠Ⅰ型前胶原羧基端肽(procollagen typeⅠcarboxy-terminal peptide，PⅠCP)酶联免疫试剂盒、大鼠Ⅲ型前胶原氨基端肽(procollagen typeⅢamino-terminal peptide，PⅢNP)酶联免疫试剂盒和大鼠Ⅰ型胶原C端肽(collagen C telopeptide typeⅠ，CTX-Ⅰ)酶联免疫试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。

3 方法

3.1 压力超负荷大鼠模型的建立 采用腹主动脉缩窄法制备压力超负荷大鼠模型[3]。Wistar大鼠适应性饲养3～5 d，术前12 h禁食，自由饮水。称重后给予3%戊巴比妥钠(45 mg/kg)，行腹腔内注射麻醉。大鼠角膜反射消失、肌力下降后，固定于手术台，腹部正中3 cm×5 cm大小面积处剃毛备皮，并以碘伏消毒。在左肋弓下缘0.5 cm、腹部正中线左侧0.5 cm处行2.0～2.5 cm纵切口，分层打开腹腔。用生理盐水纱布将肠管推向腹腔右侧，同时将胃体、脾脏向上轻推隔离，充分暴露腹主动脉段。在右肾动脉分支上0.5 cm处游离腹主动脉，平行放置7号针头(直径0.7 mm)，用4号手术缝线(直径约0.3 mm)将腹主动脉和7号针头一并结扎后，抽去针头。将脏器复位，腹腔内滴入2×105U青霉素，逐层缝合腹肌和皮肤，术后连续3 d每天肌注青霉素2×105U抗感染。假手术组开腹后只挂线，不结扎，其它程序均与手术组相同。

3.2 标本采集与处理 分别于手术后第3周、4周、8周、12周按组取材。取材前再一次称量大鼠体质量(body mass，BM)，用3%戊巴比妥钠(45 mg/kg)行腹腔注射麻醉，麻醉后迅速从腹主动脉取血，3 000 r/min离心10 min，收集血清，分装。取血后，迅速开胸摘取心脏，于4 ℃生理盐水中洗去血液，滤纸吸干，除去心脏周围组织和大血管，称取心脏质量(heart mass，HM)，计算心脏质量指数(heart mass index，HMI)：HMI =HM/BM。再剪去左右心房，右心室游离壁，保留左心室及室间隔，称取左心室质量(left ventricle mass，LVM)，计算左心室质量指数(left ventricle mass index，LVMI)：LVMI= LVM/BM。最后将分离出来的部分心肌组织置于4%中性甲醛缓冲溶液中固定，把其余的组织标本迅速置于液氮中冻存备用。

3.3 心肌组织的Masson染色 将心肌组织在4%中性甲醛缓冲溶液中固定后，经过梯度乙醇脱水、透明、浸蜡和包埋等步骤，制成石蜡块，进行连续冠状切片，厚度5 μm。切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，苏木素染核，1%盐酸乙醇分化，自来水冲洗返蓝，Masson复合染色液染色，1%磷钼酸处理，苯胺蓝染色液复染，1%冰醋酸水处理，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察结果。Masson染色后心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝色，采用Image-Pro Plus图像分析软件，每张切片随机选取5个视野测胶原面积，取其平均值作为该心肌组织胶原容积分数(collagen volume fraction, CVF)，CVF=心肌胶原纤维面积/图像总面积。

3.4 心肌HYP测定 精确称取30～100 mg液氮冻存的心肌组织，采用碱水解法测定HYP含量。以蒸馏水为空白管，以5 mg/L标准应用液为标准管，在550 nm处用比色法检测每例样本吸光度，按下式计算HYP含量：羟脯氨酸含量(mg/g)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准管含量(5 mg/L)×水解液总体积(10 mL)/组织湿重(mg)。

3.5 血清胶原代谢产物水平测定 以酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定血清PⅠCP、PⅢNP和CTX-Ⅰ水平，严格按照ELISA试剂盒说明进行操作。

4 统计学处理

采用SPSS 11.5统计软件，数据以均值±标准差(mean±SD)表示，统计方法采用两独立样本t检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 心脏及左心室质量指数的变化

与假手术组相比，模型组大鼠HMI和LVMI均明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The changes of HMI and LVMI in rats. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vssham.

图1 大鼠HMI和LVMI变化

2 心肌组织的病理变化

假手术组大鼠心肌血管周围有少量的胶原纤维存在，间质无明显胶原纤维；腹主动脉缩窄术后第3周，模型组大鼠心肌血管周围及间质可见胶原纤维沉积，心肌胶原容积分数高于假手术组(P<0.01)；第4周时心肌胶原纤维明显增多，心肌组织内可见被染成蓝色的纤维，心肌间质有较多胶原沉积，心肌胶原容积分数明显高于假手术组(P<0.01)；第8和12周时心肌血管周围及间质纤维化仍呈高水平状态(P<0.01)，且随时间延长胶原沉积明显增多，见图2。

Figure 2.Masson staining of the myocardium tissues in rats (×200) and the change of collagen volume fraction. Mean±SD.n=8.**P<0.01vssham.

图2 大鼠心肌组织Masson染色及胶原容积分数变化

3 心肌HYP含量的变化

与假手术组相比，模型组大鼠心肌HYP含量均明显增加(P<0.01)，且随时间延长大鼠HYP含量有升高的趋势，见图3。

Figure 3.The content of HYP in rats. Mean±SD.n=8.**P<0.01vssham.

图3 大鼠心肌羟脯氨酸含量

4 血清胶原代谢产物水平的变化

与假手术组相比，模型组大鼠血清PⅠCP浓度显著升高，在第4、8和12周时差异有统计学意义(P<0.05)，且随时间延长有增高的趋势；模型组大鼠血清PⅢNP浓度显著升高，CTX-Ⅰ浓度显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)，见图4。

讨 论

心肌纤维化是高血压左室肥厚的核心病理改变。通过在大鼠右肾动脉上方0.5 cm处部分结扎腹主动脉，导致心脏后负荷增加，同时缩窄部位远心端供血量减少，引起双肾动脉血流相对减少，血管紧张素Ⅱ等体液因素也参与了心肌纤维化的形成。HYP在胶原蛋白中占13.4%，在弹性蛋白中含量极少，其它蛋白中几乎不存在，因此测定心HYP的含量可以间接反映心肌胶原蛋白的水平，纤维化病灶内HYP含量常与纤维化程度呈正相关。本研究结果显示，压力超负荷大鼠心肌HYP含量明显增加，且随时间延长大鼠心肌HYP含量有升高的趋势。

Figure 4.The levels of myocardial collagen metabolites in rats. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vssham.

图4 大鼠血清胶原代谢产物水平

心肌纤维化是心肌胶原合成与降解失衡的过程。心脏细胞外基质(extracellular matrix, ECM)中含量最多的是胶原，其中85%是Ⅰ型胶原，11%为Ⅲ型胶原，其它的为Ⅳ、Ⅴ型等胶原。Ⅰ、Ⅲ型胶原之间保持适当数量和比例，是维持心脏正常结构和功能的前提。心肌胶原合成与降解失衡，导致Ⅰ、Ⅲ型胶原比例改变及过度沉积，从而形成心肌纤维化。心肌纤维化过程中伴随着多种心肌胶原代谢相关产物的增加，如：PⅠCP、PⅢNP、CTX-Ⅰ等。临床研究显示，老年舒张性心功能不全患者血清PⅠCP水平明显高于健康对照组，并且无论有无左心室肥厚，血清PⅠCP水平均明显增高，表明心肌纤维化是舒张性心功能不全的主要原因[4]。PⅠCP和PⅢNP是心肌Ⅰ型和Ⅲ型胶原的前体多肽，是前胶原转换为胶原过程中脱离前胶原的游离肽段，其随胶原纤维合成的增加而增加，是心肌Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成的间接标志[5-6]。CTX-Ⅰ是Ⅰ型胶原特异成分，在Ⅰ型胶原降解过程中释放入血，是Ⅰ型胶原降解的标志物[7]。研究显示，自发性高血压大鼠血清CTX-Ⅰ浓度并未随着胶原合成增加而升高，提示相对于较高的胶原合成率，胶原的降解可能不足[7]。心肌胶原代谢标志物主要用于评估心肌纤维化水平，定量测定血清浓度有助于了解心肌纤维化程度，对于评价疗效及近远期预后有着重要意义。本研究结果显示，压力超负荷大鼠心肌胶原代谢紊乱，心肌胶原合成增加、降解不足，导致心肌胶原沉积，从而引起心肌纤维化，乃至左室肥厚，且随时间的延长，病变更加显著。然而，压力超负荷导致心肌纤维化效应的机制尚需深入研究。有研究表明，外源性血管紧张素-(1-7)可减轻压力负荷增高所致的心肌肥厚，其机制可能与抑制心肌p-ERK1/2表达有关，这为进一步研究提供了参考[8]。

[1] 陈伟伟，高润霖，刘力生，等. 《中国心血管病报告2015》概要[J]. 中国循环杂志， 2016， 31(6)：624-632.

[2] 孙宁玲， Jaw-Wen Chen， 王继光， 等. 亚洲高血压合并左心室肥厚诊治专家共识[J]. 中华高血压杂志， 2016， 24(7)：619-627.

[3] Doering CW, Jalil JE, Janicki JS, et al. Collagen network remodelling and diastolic stiffness of the rat left ventricle with pressure overload hypertrophy[J]. Cardiovasc Res, 1988, 22(10):686-695.

[4] Roongsritong C, Bradley J, Sutthiwan P, et al. Elevated carboxy-terminal peptide of procollagen type I in elderly patients with diastolic dysfunction[J]. Am J Med Sci, 2006, 331(3):131-133.

[5] Barasch E, Gottdiener JS, Aurigemma G, et al. The relationship between serum markers of collagen turnover and cardiovascular outcome in the elderly: the Cardiovascular Health Study[J]. Circ Heart Fail, 2011, 4(6):733-739.

[6] Ho CY, López B, Coelho-Filho OR, et al. Myocardial fibrosis as an early manifestation of hypertrophic cardiomyopathy[J]. N Engl J Med, 2010, 363(6):552-563.

[7] Díez J, Panizo A, Gil MJ, et al. Serum markers of collagen type I metabolism in spontaneously hypertensive rats: relation to myocardial fibrosis[J]. Circulation, 1996, 93(5):1026-1032.

[8] 何建桂， 黄艺仪， 马 虹， 等. 血管紧张素-(1-7)对心肌肥厚的影响及其与细胞外信号调节激酶的关系[J]. 中国病理生理杂志， 2005， 21(9)：1713-1716.

(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Dynamic changes of myocardial collagen metabolism in pressure-overloaded rats

LV Shi-chao1, ZHANG Jun-ping1, LI Meng2, WU Mei-fang2, WANG Qiang2, WANG Xiao-jing2, XU Ling2

(1DepartmentofGeriatricMedicine,FirstTeachingHospital,2GraduateSchool,TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China.E-mail:tjzhtcm@163.com)

AIM: To observe the dynamic changes of myocardial collagen metabolism in pressure-overloaded rats.METHODS: The pressure-overloaded rat model was established by partial abdominal aortic coarctation. The rats underwent surgery but not constrictive were used as sham-operated control group. The rats were euthanized at 3, 4, 8 and 12 weeks. The body mass, heart mass and left ventricular mass were weighed, and the heart mass index (HMI) and left ventricle mass index (LVMI) were calculated. Masson trichrome staining was used on the myocardial sections, alkaline hydrolysis was used to detect the content of myocardial hydroxyproline (HYP), and the serum levels of procollagen type I carboxy-terminal peptide (PICP), procollagen type III amino-terminal peptide (PIIINT), and collagen C telopeptide type I (CTX-I) were also measured. RESULTS: Compared with sham-operated control group, the collagen deposition was evident, and collagen volume fraction (CVF) was increased significantly in model group (P<0.01), which further increased over time. HMI, LVMI and HYP significantly increased in model group (P<0.05), and HYP showed a tendency to increase over time. In addition, the serum concentration of PICP was increased significantly in model group, and the difference was significant at 4, 8 and 12 weeks (P<0.05). The serum concentration of PIIINP was increased significantly, but CTX-I was lowered significantly in model group (P<0.01). CONCLUSION: In the state of pressure overload, myocardial collagen metabolism is in disorder, and myocardial fibrosis is the major pathological change, which further increases over time.

Abdominal aortic coarctation; Pressure overload; Myocardium collagen; Myocardial fibrosis

1000- 4718(2017)04- 0740- 04

2016- 10- 10

2017- 01- 20

国家自然科学基金资助项目(No. 81603559)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.027

△通讯作者 Tel： 022-27432016； E-mail： tjzhtcm@163.com