LMP1经TRADD促进鼻咽癌SP18细胞增殖*

肖 娟， 张先锋， 刘重元， 罗招阳， 朱建思， 张 玲， 张志伟△

(南华大学 1附属第二医院耳鼻喉科， 2医学院肿瘤研究所，肿瘤细胞与分子病理学湖南省重点实验室， 3医学院临床医学卓越医师班，湖南 衡阳 421001)

LMP1经TRADD促进鼻咽癌SP18细胞增殖*

肖 娟1， 张先锋1， 刘重元2， 罗招阳2， 朱建思2， 张 玲3， 张志伟2△

(南华大学1附属第二医院耳鼻喉科，2医学院肿瘤研究所，肿瘤细胞与分子病理学湖南省重点实验室，3医学院临床医学卓越医师班，湖南 衡阳 421001)

目的： 探讨潜伏性膜蛋白1(LMP1)羧基末端活化区2(CTAR2)的肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域(TRADD)在鼻咽癌SP18细胞增殖中的作用及机制。方法: 首先建立表达LMP1及CTAR2突变型LMP1(LMP1TRADD)的SP18细胞系。其次采用细胞生长曲线、平皿集落形成实验、软琼脂集落实验和流式细胞术观察LMP1TRADD对SP18细胞增殖的影响。然后选用基因芯片检测SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞间的差异表达基因。结果: 细胞生长曲线、软琼脂集落和平皿集落形成实验结果均显示，SP18-LMP1细胞生长与集落形成能力均较SP18-LMP1TRADD细胞强(P<0.01)。流式细胞术检测结果显示，SP18-LMP1细胞的增殖指数较SP18-LMP1TRADD细胞高(P<0.01)。筛选出63个增殖相关基因，其中SP18-LMP1TRADD细胞中上调的基因33个，下调的基因30个。结论: TRADD活性区是LMP1促进SP18细胞增殖的重要功能活性位点。LMP1可能通过TRADD提高细胞增殖指数，诱导SP18细胞增殖。

鼻咽癌； 潜伏性膜蛋白1； 肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域； 基因芯片； 细胞增殖

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是东南亚及我国南方(广东、湖南、广西和香港等)地区最常见的恶性肿瘤之一[1]。曾益新等[2]报道建立了鼻咽癌干细胞样SP细胞系，具有极强的生存能力，被认为是鼻咽癌发生和复发的主要原因之一[3]。潜伏性膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP1)被认为是EB病毒重要的致瘤蛋白[4-5]。LMP1胞浆区包括3个羧基末端活化区(carboxy-terminal activating region，CTAR)，分别为CTAR1、CTAR2和CTAR3[6-8]，其中CTAR2包含肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域(tumour necrosis factor receptor-associated death domain，TRADD)，是羧基末端重要的活性转化位点[9]。然而，LMP1在鼻咽癌发生与发展中的作用及机制仍不十分清楚，本研究旨在探讨LMP1在鼻咽癌SP细胞增殖中的作用及机制，为进一步阐明EB病毒在鼻咽癌发病中的作用提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 材料

鼻咽癌SP18细胞由中山大学肿瘤研究所惠赠，用含5%小牛血清(购自杭州四季青公司)的RPMI-1640(Gibco)培养。pLNSX-LMP1和pLNSX-LMP1TRADD[6-9]逆转录病毒质粒由中南大学肿瘤研究所惠赠。

2 方法

2.1 表达LMP1和LMP1TRADD细胞的建立 接种合适浓度SP18细胞种于6孔板培养，用收集的RV-LMP1和RV-LMP1TRADD逆转录病毒与8 mg/L聚凝胺37 ℃孵育(感染)SP18细胞2次(每次作用3～4 h，每次间隔8～12 h)，800 mg/L G418筛选2～3周，汇合克隆扩大培养，建成稳定传代的转染细胞系(SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD)，然后，采用免疫荧光检测SP18细胞中LMP1和LMP1TRADD蛋白的表达。

2.2 免疫荧光观察 取SP18-LMP1细胞和SP18-LMP1TRADD细胞，制备细胞爬片，用甲醇与丙酮(1∶1)固定、洗片、干燥后，用抗 LMP1的 I 抗(1∶500)标记1 h(37 ℃)，洗片后用FITC标记的羊抗鼠 II 抗标计1 h(37 ℃)，洗涤后甘油封片，于荧光显微镜下观察并拍照。

2.3 绘制生长曲线 取对数生长期SP18-LMP1细胞和SP18-LMP1TRADD细胞(2×103)接种于24孔板，每组实验设3个平行孔，每天计数细胞数，每次重复3次，取平均值代表细胞数，总共检测6 d，将细胞数绘制在坐标纸上，即得出细胞的生长曲线。

2.4 平板集落形成实验 取对数生长期的SP18-LMP1细胞和SP18-LMP1TRADD细胞，制成细胞悬液，按每孔300个细胞接种于24孔板中，静置培养2周。取出培养皿，用PBS漂洗2次，甲醇固定15 min后，0.4%结晶紫染色，肉眼直接计数集落数，或在显微镜下计数大于50个细胞的集落。然后，按公式计算集落形成率：集落形成率(%)=集落数/接种细胞数×100%。

2.5 软琼脂集落实验 用RPMI-1640培养基、0.6%琼脂糖配制底层琼脂，取1.5 mL均匀铺于6孔板内，4 ℃放置10 min，另外用细胞(每孔2×103个细胞)、RPMI-1640培养基、0.3%琼脂糖配制顶层琼脂，将顶层琼脂铺于底层琼脂上，37 ℃、5% CO2温箱内连续培养2周后，计数集落数。实验分SP18-LMP1细胞和SP18-LMP1TRADD细胞2组，每组3个平行孔，集落形成率计数：于倒置显微镜下观察集落(≥50个细胞为1个集落)的数目和大小，计算出细胞集落形成率：集落形成率(%)=集落数/接种细胞数×100%。

2.6 流式细胞术检测细胞周期 取对数生长期SP18-LMP1细胞和SP18-LMP1TRADD细胞，长至80%融合时，分别收集细胞，制成单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，用4 ℃ PBS溶液重悬细胞，1 000 r/min离心5 min，重复1次；将收集的细胞用4 ℃ 75%乙醇固定细胞，置冰盒中送检。样本上机前作如下处理： 将乙醇固定的细胞离心洗涤，去上清，摇匀； 加RNA酶50 μL(浓度为0.5 g/L)，37 ℃水浴30 min； 加碘化丙啶50 μL，浓度为1 g/L，振荡混匀，避光置冰箱30 min； 300目尼龙网滤过，上机检测，计数10 000个细胞，进行细胞周期检测。然后计算细胞的增殖指数(proliferation index, PI)，PI (%)=(S+G2)/(G1+S+G2)×100%。

2.7 基因芯片检测 取对数生长期的SP18-LMP1细胞和SP18-LMP1TRADD细胞，长至80%融合时，PBS漂洗2次，加入1 mL的TRIzol于培养瓶中(1×109/L个细胞)，反复吹打，混匀后收集，送上海伯豪生物技术有限公司进行基因芯片检测，比较 SP18-LMP1细胞和SP18-LMP1TRADD细胞的差异表达基因。采用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，将实验结果转换成数字型数据保存，并对原始数据进行分析，列出倍数≥ 2(上调基因)或 ≤ 0.5(下调基因)的差异表达基因。

3 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件处理所有的数据，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，细胞克隆和集落数及细胞增殖指数采用秩和检验，细胞周期采用2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 建立表达LMP1和LMP1TRADD的SP18细胞系

逆转录病毒感染SP18细胞后，G418筛选汇合克隆，免疫荧光检测LMP1的表达，结果显示LMP1和LMP1TRADD在SP18细胞浆和胞膜表达，建立了稳定表达LMP1及LMP1TRADD的SP18细胞系，即SP18-LMP1细胞和SP18-LMP1TRADD细胞，用于后续实验(图1)。

Figure 1.The expression of LMP1TRADDin the SP18 cells detected by the method of immunofluorescence (×400).

图1 免疫荧光观察LMP1TRADD在SP18细胞中的表达

2 LMP1TRADD对SP18细胞生长的影响

绘制出生长曲线，观察LMP1TRADD对SP18细胞生长的影响。结果显示SP18-LMP1细胞生长较SP18-LMP1TRADD细胞生长快(P<0.05)，提示TRADD区是LMP1促进SP18细胞增殖的重要功能活性区，见图2。

Figure 2.The growth curves of SP18-LMP1 cells and SP18-LMP1TRADDcells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSP18-LMP1TRADDcells.

图2 SP18-LMP1与SP18-LMP1TRADD细胞的生长曲线

3 LMP1TRADD对SP18细胞集落形成的影响

平皿集落形成实验观察LMP1TRADD对SP18细胞集落形成的影响。结果显示，SP18-LMP1较SP18-LMP1TRADD细胞的集落数多，体积大(表1)，说明LMP1具有促SP18细胞增殖能力，而LMP1TRADD促SP18细胞增殖的能力降低(P<0.05)，提示TRADD区是LMP1促进SP18细胞增殖的重要功能活性区。

4 LMP1TRADD对SP18细胞集落形成的影响

软琼脂集落形成实验观察LMP1TRADD对SP18细胞集落形成的影响，结果显示，SP18-LMP1细胞较SP18-LMP1TRADD细胞的集落数多，体积大(表1)，说明LMP1TRADD促SP18细胞生长增殖的能力较LMP1降低(P<0.05)，同样提示TRADD区是LMP1促进SP18细胞增殖的重要功能活性区。

表1 SP18-LMP1与SP18-LMP1TRADD细胞集落形成数的比较

Table 1.The comparison of forming colony numbers between SP18-LMP1 cells and SP18-LMP1TRADDcells (Mean±SD.n=3)

CellsColonynumberFocinumberSP18-LMP1186±38964±149SP18-LMP1TRADD 126±26* 672±118*

*P<0.05vsSP18-LMP1 cells.

5 LMP1TRADD对SP18细胞增殖指数的影响

用流式细胞术检测了SP18-LMP1细胞和SP18-LMP1TRADD细胞的周期分布。结果表明SP18-LMP1细胞的S期和G2期百分率较SP18-LMP1TRADD细胞明显增多，而G1期减少，细胞增殖指数增高(表2)，提示LMP1通过TRADD活性区影响细胞的增殖指数，促进SP18细胞增殖。

表2 SP18-LMP1细胞与SP18-LMP1TRADD细胞的细胞周期分布及细胞增殖指数的比较

Table 2.The proliferation index and distribution of cell cycle of SP18-LMP1 cells and SP18-LMP1TRADDcells (Mean±SD.n=3)

CellsG1(%)SandG2(%)Proliferationindex(%)SP18-LMP112.6±1.287.4±2.887.4SP18-LMP1TRADD30.8±1.569.2±2.2*69.2*

*P<0.05vsSP18-LMP1 cells.

6 SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞差异基因的筛选

采用Agilent基因芯片分析，筛选获得SP18-LMP1 细胞和 SP18-LMP1TRADD细胞间差异倍数大于2或小于0.5的增殖相关基因63个，在SP18- LMP1TRADD细胞中上调基因33个，下调基因30个，具体见表3。

讨 论

鼻咽癌SP18细胞曾被报道具有干细胞样特性[2]。LMP1是EB病毒基因组编码的具有促细胞癌变和转移作用的重要致瘤蛋白，由386个氨基酸(amino acids，aa)残基组成的跨膜糖蛋白，包括亲水性氨基端胞浆区、6个不同的疏水性跨膜区和亲水性羧基端胞浆区3个功能活性区结构域[6-8]，其中CTAR2位于351～386 aa，能与TRADD蛋白结合介导高水平NF-κB及AP-1的活化[8-9]。LMP1具有类似CD40的自动聚合活化功能，在细胞内活化多条信号通路中的致瘤蛋白[4-5]。我们的结果显示CTAR2的TRADD活性区突变后(LMP1TRADD)，SP18-LMP1TRADD细胞生长速度较SP18-LMP1细胞减缓，且增殖能力降低，以及细胞的增殖指数也降低，说明TRADD活性区是LMP1羧基末端促SP18细胞增殖的重要功能活性位点。为了解TRADD活性区影响SP18细胞增殖的作用机制，本研究采用Agilent基因芯片检测出63个TRADD活性区参与调节的相关基因，这些基因涉及CYP1A1和NGFR等，它们可能参与调节SP18细胞的增殖。

表3 LMP1-TRADD活性区调节SP18细胞的增殖相关基因

Table 3 (continued)

“↑” showed up-regulated genes in SP18-LMP1TRADDcells; “↓” showed down-regulated genes.

细胞色素P450家族1(cytochrome P450 family 1，CYP1)是与多种内、外源性化合物代谢相关的CYP450酶，已知有2个亚型，即CYP1A与CYP1B。其中CYP1A又可分为CYP1A1和CYP1A2[10]。CYP1A1是细胞色素P450家族主要的代谢酶之一，能通过氧化、还原和水解作用，改变体内化学物质的功能或使其分解[11]。CYP1A1主要位于肝外组织，参与多种类固醇激素、药物和部分前致癌物的代谢，体内、外多因素可诱导其表达[12]。有研究报道，CYP1A1参与雌二醇代谢的部分代谢产物能促进乳腺癌的发生与发展[13]。本研究推测LMP1-TRADD活性区参与CYP1A1的表达可能与其诱导细胞的增殖，以及参与鼻咽癌的发生有关。

神经生长因子受体(nerve growth factor receptor，NGFR)在体内分布十分广泛，存在于神经嵴和交感神经的感觉神经细胞膜上[14]。有研究报道，在一些非神经细胞的胞膜上，也存在NGFR[15]。NGFR主要有2种[16]，一为高亲和力的受体TrkA；另一为低亲和力的受体p75NGFR。有文献报道，TrkA可促进乳腺癌、前列腺癌和膀胱癌的生长、侵袭和转移，其在组织中表达呈阳性，提示患者可能预后不良[17]。有研究报道，p75NGFR可抑制乳腺癌、前列腺癌等的生长、侵袭和转移，其在组织中阳性表达患者预后良好[18]。在膀胱癌和前列腺癌中研究发现，p75NGFR通过抑制细胞增殖和促进调亡，抑制肿瘤及其转移[19]。本研究发现，SP18-LMP1细胞中NGFR表达下调，而SP18-LMP1TRADD细胞中表达上调，提示TRADD活性区抑制NGFR的表达。由于NGFR这2种受体的功能作用完全不同，因此推测LMP1参与下调NGFR的表达可能与p75NGFR有关，至于具体机制有待以后的进一步研究。

总之，本研究鉴定了63个TRADD活性区调节的鼻咽癌SP18细胞增殖相关基因。至于LMP1如何调控这些基因的表达，以及这些基因如何影响鼻咽癌SP18细胞的增殖，及相互之间的具体调节网络，仍有待以后的深入研究。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

XIAO Juan1, ZHANG Xian-feng1, LIU Zhong-yuan2, LUO Zhao-yang2, ZHU Jian-si2,ZHANG Ling3, ZHANG Zhi-wei2

(1DepartmentofOtorhinolaryngology,TheSecondAffiliatedHospital，2CancerInstituteofMedicalCollege,KeyLaboratoryofCancerCellularandMolecularPathologyinHunanProvince，3ClinicalMedicineExcellentProgramforUndergraduateofMedicalCollege,UniversityofSouthernChina,Hengyang421001,China.E-mail:nhdxzzw@qq.com)

AIM: To investigate the effects of TNF receptor-associated death domains (TRADD) of latent membrane protein 1 (LMP1) on the proliferation of nasopharyngeal cancer SP18 cells. METHODS: The SP18-LMP1 cells and SP18-LMP1TRADDcells, which expressed LMP1 and LMP1TRADDproteins, respectively, were established. The proliferation of SP18 cells affected by LMP1TRADDwas detected by cell counting to analyze the cell growth curve, and by colony formation assay, soft agar formation assay, and flow cytometry. Moreover, the expression profile of differential genes between SP18-LMP1 cells and SP18-LMP1TRADDcells was analyzed by gene chips. RESULTS: The cell growth curve, and the results of colony formation and soft agar formation displayed that the growth velocity and colony forming ability of SP18-LMP1 cells were stronger than those of SP18-LMP1TRADDcells (P<0.01). The results of flow cytometry analysis showed that the proliferation index of SP18-LMP1 cells was higher than that of SP18-LMP1TRADDcells (P<0.01). Sixty-three differentially expressed genes associated with cell proliferation were screened out, in which 33 genes were up-regulated and 30 were down-regulated in the SP18-LMP1TRADDcells. CONCLUSION: TRADD active region is an important functional site of LMP1 to promote the proliferation of SP18 cells. LMP1 may improve the cell proliferation index and induce the proliferation of SP18 cells through TRADD.

Nasopharyngeal carcinoma; Latent membrane protein 1; TNF receptor-associated death domains; Gene chips; Cell proliferation

1000- 4718(2017)04- 0682- 06

2016- 04- 21

2017- 01- 10

湖南省自然科学衡阳联合基金资助项目(No. 12JJ9033)；湖南省自然科学基金资助项目(No. 13JJ3079)；湖南省科技厅项目(No. 2013SK3118； No. 2014SK3081)；湖南省高校创新平台基金资助项目(No. 10K052; No. 12K094; No. 13K083)；湖南省教育厅课题(No. 11C1112; No. 12C0340)；湖南省卫生厅项目(No. B2014-163；No. B2013-048)

R318.0

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.017

Proliferation of nasopharyngeal carcinoma SP18 cells promoted by latent membrane protein 1 through TNF receptor-associated death domains

△通讯作者 Tel: 0734-8281075； E-mail: nhdxzzw@qq.com