补肾抗癌方配方颗粒对HeLa细胞增殖与细胞凋亡的影响及其机制的初步研究

王青华 朱敏丰

浙江省湖州市中医院 浙江 湖州 313000

实验研究

补肾抗癌方配方颗粒对HeLa细胞增殖与细胞凋亡的影响及其机制的初步研究

王青华 朱敏丰

浙江省湖州市中医院 浙江 湖州 313000

目的：考察自拟补肾抗癌方配方颗粒对宫颈癌细胞HeLa细胞增殖及细胞凋亡的影响，并对其机制进行初步探讨。方法：MTT法检测不同浓度自拟补肾抗癌方配方颗粒分别在24、48、72小时对HeLa细胞的抑制作用，流式细胞术检测补肾抗癌方配方颗粒对细胞周期的影响，Western Blot法检测Caspase-3蛋白的表达。通过进一步检测HeLa细胞内源性活性氧及氧化还原实验，考察补肾抗癌方配方颗粒对HeLa细胞内源性活性氧（ROS）分泌、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，还原型谷胱甘肽（GSH）的含量影响。结果：自拟补肾抗癌方配方颗粒对HeLa细胞的生长具有抑制作用；能够诱导细胞周期发生变化，将细胞阻滞在G0期，抑制细胞增殖；能够剂量依赖性地激活Caspase-3蛋白，调节细胞凋亡；另外，还能够通过增加细胞内抗氧化酶（剂）SOD和GSH的活性，降低CAT的活性，来增加细胞内ROS的自分泌，调节氧化还原状态。结论：自拟补肾抗癌方配方颗粒对宫颈癌HeLa细胞增殖有一定的抑制作用，对其凋亡有一定的诱导作用，这种作用可能与其改变细胞内部的氧化还原状态有关。

补肾抗癌方 细胞增殖 细胞凋亡 Caspase-3 氧化还原 实验研究

自拟补肾抗癌方配方颗粒由知母、生地黄、黄柏、墨旱莲、重楼、泽泻、白花蛇舌草组成，本文旨在通过体外细胞实验的方法，初步观察自拟补肾抗癌方配方颗粒对人宫颈癌HeLa细胞的增殖及凋亡的作用，并初步探讨其可能机制，以期为药品研究开发和临床治疗应用提供实验依据及理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂：分述如下。

1.1.1 试验药物：补肾抗癌方配方颗粒：知母（批号1511002S）5g，生地黄（批号1511001W）5g，黄柏（批号1511001S）3g，墨旱莲（批号1511001W）10g，重楼（批号1511001W）7.5g，泽泻（批号1511002W）5g，白花蛇舌草（批号1511001S）15g。全部药物均由华润三九医药股份有限公司生产。给药前，将一剂补肾抗癌方配方颗粒加入50.5ml磷酸缓冲盐溶液（PBS）（pH=7.0）溶解，通过0.22μm的微孔滤膜，配制成1g/ml的母液备用。

1.1.2 试剂：RPMI-1640培养基（Gibco公司，批号8111024）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批号NVW0526）；噻唑蓝（MTT）（碧云天生物技术研究所，批号C0007）；二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司，批号D8419）；胰蛋白酶细胞消化液（碧云天，批号CD202）；碘化丙啶（PI）（碧云天，批号ST512）；RNA酶（碧云天，批号9001-99-4）；β-acting（Santa Cruz Biotechnology，批号D0212）；Caspase-3抗体（Cell SignalingTechnology公司，货号14220）；HRP标记山羊抗小鼠（中杉金桥，批号107936）；HRP标记山羊抗兔（中杉金桥，批号108093）；BCA蛋白定量试剂盒（碧云天，货号P0015）；细胞裂解液（碧云天，货号P0014B）；Caspase-3单克隆抗体（Cell SignalingTechnology公司，货号14220）；鲁米诺（Nerck公司，批号2304331）；超氧化物歧化酶SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20150826）；谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20150923）；还原型谷胱甘肽试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20151016）

1.1.3 仪器：恒温细胞培养箱（日本SANYO公司）；低温离心机（德国Eppendorf公司）；多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；CKX41倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；洁净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；水平摇床（北京市六一仪器厂）；电子天平（上海METTLER TOLEDO有限公司）；蛋白电泳系统（美国Bio-Rad公司）；蛋白转膜系统（美国Bio-Rad公司）；电热压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；ECL凝胶成像系统（GE Healthcare公司）；流式细胞仪（美国Beckman Coulter）；细胞培养皿（美国Corning公司）；0.22μm微孔滤膜（天津市科亿隆实验设备有限公司）

1.2 细胞培养及药物处理：人宫颈癌细胞（HeLa）购买自美国ATCC细胞库。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37℃、5%CO2、95%湿度的恒温培养箱中进行常规培养。取对数生长期细胞，加入胰蛋白酶进行细胞的消化处理，之后将细胞悬液收集于10ml的离心管中，以1000～1200rpm离心5min，再将沉淀细胞用完全培养液进行重悬，按1∶3在相同培养条件下进行传代培养，部分细胞用于如下细胞实验。

1.3 体外细胞增殖试验：采用MTT法检测HeLa细胞增殖变化。取对数生长期的细胞，以每孔约5～8×103个的细胞密度接种于96孔细胞培养板中；过夜贴壁后，分别加入终浓度为1、3、10mg/L方配方颗粒，每个药物浓度设6个复孔，空白对照组中加入相同体积的完全培养液，继续培养24、48、72h后，分别加入5mg/mlMTT（10μl/孔）溶液，4h后倾去培养液，每孔加入150μlDMSO溶液，振荡10min使结晶充分溶解，酶联免疫检测仪测定570nm吸光度值（A）。细胞增殖抑制率=(A对照组－A药物组)/A对照组×100%。实验重复3次。

1.4 细胞周期分布的测定：利用流式细胞仪对细胞周期分布进行监测分析。取对数生长的HeLa细胞，常规胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度至1×105个/ml并接种于细胞板中。细胞贴壁生长后，分别加入不同浓度（1、3、10mg/L）配方颗粒，空白对照组给予等体积培养液；分别于培养24、48、72h时加入胰酶消化终止培养，收集细胞离心（1000rpm，5min），弃上清后用预冷的PBS反复洗涤细胞2次，再用70%冷乙醇使细胞悬浮固定，置于4℃过夜；检测时，1500rpm离心5min去除乙醇，加入RNase置于37℃消化30min，调整细胞密度至1×106个/ ml，加入PI混匀，室温避光孵育30min进行染色，立即用流式细胞仪进行检测，采用Mod Fit 3.0软件对细胞周期分布情况进行分析。每组实验重复3次。

1.5 Caspase-3蛋白表达检测：采用蛋白免疫印迹（Western Blot）方法对Caspase-3的蛋白表达量进行检测。将药物处理72h后的细胞弃去培养液，用PBS将细胞清洗3遍；加入细胞裂解液，冰上裂解30min后收集细胞，4℃、12000rpm离心15min；吸取上清液，利用BCA法进行蛋白定量。将变性的细胞蛋白经12%分离胶和4%浓缩胶SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，转移印迹至PVDF膜上，再用5%脱脂牛奶室温轻摇封闭1h，用PBS-T漂洗，放入一抗（1:1000）中4℃轻摇孵育过夜；PBS-T清洗3遍，加入二抗（1:5000）室温轻摇孵育1h，漂洗后加ECL显色液进行显色，利用化学发光成像仪进行显色曝光。

1.6 细胞自分泌总活性氧（ROS）测定：用化学发光法测定ROS的水平。收集细胞，制备细胞悬液，使用不含酚红的培养液调整细胞浓度至2×106个/ml，预热至37℃，加入鲁米诺发光试剂，置于恒温37℃的发光仪测定室中，测定1min内的发光强度。

1.7 细胞内SOD活性检测：用碱性二甲基亚枫—鲁米诺化学发光法测定。利用SOD标准品绘制SOD标准曲线。样品测定时，将细胞制成密度为1×106个/ml悬液，将细胞破碎并冷冻离心，取上清液加入到测量管中，加入20μl邻苯三酚，用鲁米诺缓冲液定容至1ml。立即测定发光强度。

1.8 细胞内还原型谷胱甘肽（GSH）含量的检测：采用分光光度法测定。收集细胞，制备细胞悬液（1×106个/ ml），将细胞破碎处理后加入300μl25%偏磷酸沉淀蛋白。取100μl上清液加到试管中，再加入1.8mlPBS和100μlOPT，混匀，室温反应15min。测定420nm处的荧光值。

1.9 细胞内过氧化氢酶（CAT）活性检测：利用紫外分光光度法测定CAT活性。首先测定标准OD值。收集细胞上清液0.5ml，加入过氧化氢在冰水浴中反应3min，再加入1ml硫酸反应3min，最后加入7ml高锰酸钾反应1min，在480nm处测定吸光度值。

2 结果

2.1 补肾抗癌方配方颗粒对HeLa细胞增殖的影响：24h时，3、10mg/L配方颗粒能够显著抑制细胞增殖，48h和72h时，所有浓度药物均能抑制，与空白对照组比较，具有显著性差异（P＜0.05）；同一时间点随浓度的增加，抑制作用增强；同一浓度下，随时间的延长，抑制率增加。表明配方颗粒对HeLa细胞的抑制作用具有时间和剂量依赖性。见表1。

2.2 补肾抗癌方配方颗粒对HeLa细胞周期分布的影响：经配方颗粒处理后，所有时间点HeLa细胞中G0/G1期和G2/M期细胞所占比例均发生显著改变（P＜0.05）。在同一时间点，随着药物浓度的增加，G0/G1期细胞所占比例增加，S和G2/M期细胞均减少；在同一浓度药物作用下，随作用时间延长，G0/G1期细胞有所增加，而S和G2/M期细胞所占比例均减少。结果表明配方颗粒可使G0期细胞增多（P＜0.05），M期细胞减少（P＜0.05），将细胞阻滞在G0期，并缩短有丝分裂期，抑制细胞增殖，并且呈现时间和剂量上的依赖性。见表2。

表1 不同浓度配方颗粒对HeLa细胞的生长抑制作用（±s,n=6）

表1 不同浓度配方颗粒对HeLa细胞的生长抑制作用（±s,n=6）

注：与空白对照比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

抑制率（%）0 8.3 12.9*20.9**0 14.8*23.8***29.1***0 11.5*24.9**34.9***A570药物浓度（mg/L）组别空白对照药物作用24h 0 1 3 1空白对照药物作用48h 0 0 1 3 1空白对照药物作用72h 0 0 1 3 1 0 0.517±0.011 0.474±0.047 0.450±0.043 0.409±0.039 0.652±0.034 0.555±0.022 0.497±0.035 0.462±0.030 0.862±0.040 0.763±0.014 0.647±0.024 0.561±0.040

表2 射线照射和配方颗粒对HeLa细胞周期的影响（±s,n=3）

表2 射线照射和配方颗粒对HeLa细胞周期的影响（±s,n=3）

注：与空白对照比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 各期细胞所占百分比药物浓度（mg/L）S空白对照药物作用24h药物作用48h -1 3 1 1 3 1药物作用72h G2/M 25.3±2.85 16.0±0.98*12.9±1.33**15.8±1.67*15.7±0.77*15.6±1.70*15.7±1.11*12.0±0.18**12.1±1.88**9.5±1.42**0 1 3 1 0 G0/G152.3±1.03 67.0±2.10*73.4±2.09**74.4±1.19**67.5±2.09*68.0±2.22*74.7±1.50**75.0±2.17**75.1±2.30**75.7±1.48**22.4±1.24 17.1±3.38 13.7±1.07 9.8±2.32*16.8±3.97 16.4±1.48 9.7±2.80 13.1±3.28 12.9±1.07 15.5±2.85

2.3 补肾抗癌方配方颗粒对HeLa细胞内Caspase-3蛋白表达的影响：配方颗粒作用于HeLa细胞后72h采用Western Blot测定蛋白表达量。随着浓度剂量增加，酶原形式的Caspase-3表达量逐渐减少，切割形式的Caspase-3表达量增加，说明配方颗粒能够激活HeLa细胞内Caspase-3，诱导细胞凋亡。见图1。

图1 补肾抗癌方配方颗粒对Caspase-3的影响

2.4 补肾抗癌方配方颗粒对HeLa细胞自分泌总ROS的影响：与空白对照组比较，在不同时间点，不同浓度的配方颗粒均能显著抑制HeLa细胞内总ROS的自分泌（P＜0.05）。在同一时间点，增大配方颗粒的浓度，则抑制率升高，呈剂量依赖性；对于同一浓度，随作用时间延长，抑制作用也随之增加，呈时间依赖关系。表明配方颗粒能够时间和剂量依赖性地抑制HeLa细胞总ROS的自分泌。见表3。

表3 配方颗粒对HeLa细胞自分泌总ROS的影响

2.5 补肾抗癌方配方颗粒对HeLa细胞抗氧化酶（剂）活性的影响：药物作用24h时，10mg/L的配方颗粒能显著引起SOD活性增强和CAT活性降低（P＜0.05）；48h时所有剂量药物都能显著增强SOD活性，而3和10mg/L的药物能够降低CAT活性和GSH含量（P＜0.05）；72h时所有剂量药物都能显著增强SOD活性和GSH含量，同时降低CAT活性（P＜0.05）。在同一剂量的配方颗粒作用下，随着作用时间延长，能够增加HeLa细胞内抗氧化酶SOD和GSH活性，降低CAT活性；在同一时间内，随着药物浓度增加，SOD和GSH活性随之增强，但CAT活性降低。表明配方颗粒能够增强SOD和GSH活性并降低CAT活性，且以上指标均具有时间和剂量依赖性。见表4。

表4 配方颗粒对细胞内源抗氧化酶（剂）的影响（±s)

表4 配方颗粒对细胞内源抗氧化酶（剂）的影响（±s)

注：与空白对照比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

GSH (A/106cells) 0.49±0.01 0.49±0.04 0.48±0.06 0.48±0.02 0.49±0.01 0.53±0.01*0.55±0.05*0.50±0.03*0.53±0.02*0.57±0.04**组别空白对照药物作用24h药物浓度（mg/L）0 1 3 1药物作用48h 0 1 3 1药物作用72h 0 1 3 1 0 SOD (U/106cells) 533±96 574±62 652±69 846±161*702±155*843±83*1194±151**1057±78**1194±144**1600±216***CAT (K/106cells) 0.74±0.01 0.71±0.03 0.64±0.06 0.46±0.02**0.67±0.05 0.61±0.01*0.37±0.05**0.41±0.02**0.37±0.05**0.26±0.05***

3 讨论

实验结果表明补肾抗癌方配方颗粒可能具有治疗宫颈癌的潜力。它能使细胞周期的分布发生变化，导致大多数细胞停滞于G0期，阻滞向G1期的转化，从而降低了DNA的合成和有丝分裂的进程，减慢了细胞增殖并促进细胞的分化。能够促使Caspase-3激活，剂量依赖性地增加Caspase-3从酶原形式转变成为活化状态的小片段，从而发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用。能够降低HeLa细胞内总ROS的自分泌，同时上调SOD活性和GSH的含量，降低CAT活性，表明补肾抗癌方配方颗粒可能是通过改变细胞内的氧化还原状态，从而调节ROS的动态平衡。综上所述，本研究证实补肾抗癌方配方颗粒具有抑制HeLa细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用，其机制可能与调节抗氧化酶活性，从而改变肿瘤细胞内在氧化还原状态有关。

2016-10-12