反相HPLC法测定比格犬血浆中白藜芦醇含量及其药代动力学研究

甄玉改

反相HPLC法测定比格犬血浆中白藜芦醇含量及其药代动力学研究

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目的建立测定比格犬血浆中白藜芦醇的HPLC法，并研究白藜芦醇在比格犬体内的药代动力学。方法色谱柱为C18柱，流动相乙腈-水（32∶68），流速为1.0m l/min，检测波长306 nm：血浆样品用乙酸乙酯萃取法预处理。结果线性范围0.1～10.0μg/m l，相关系数r=0.9995。日内RSD<10%，日间RSD<15%，回收率97.6%～103.3%。比格犬口服给药白藜芦醇主要药代动力学参数为15min后血浆药物浓度达峰值，Cmax为4.789μg/ml，半衰期为135min。结论该方法灵敏度高，操作方便，适用于白藜芦醇在比格犬体内的药代动力学研究：本品口服吸收快消除迅速。

白藜芦醇；药代动力学；比格犬；反相HPLC法

白黎芦醇（Resveratrol，见图1Ⅰ）化学名称为3，5，4’-三羟基-二苯乙烯，是一种多酚类植物抗毒素，具有抗氧化活性，主要存在于葡萄［1］、葡萄汁、红酒及其他植物提取物中［2-4］，是一种植物在恶劣环境下或遭到病原体侵害时，自身分泌的一种可抵御霉菌感染的抗生素。白藜芦醇的抗心血管疾病作用因“法国悖论”而被学者们认识，进一步研究发现，白藜芦醇还具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节、抗菌抗病毒、抗衰老及雌激素样活性等多种药理作用［5-7］，但有关其在比格犬体内药代动力学的研究尚未见报道。为阐明白藜芦醇在比格犬体内的药代动力学规律，本文建立了以液液萃取为前处理的反相HPLC法，并研究了白藜芦醇单次口服给药后在比格犬体内的药代动力学过程。

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂白藜芦醇对照品和根皮素（图1Ⅱ）对照品购自中国药品生物制品检定所；白藜芦醇原料药购自西安小草植物科技有限公司，含量＞98%；乙腈为进口色谱纯（美国TEDIA公司）；其他试剂为国产分析纯；色谱用水为超纯水。

图1 白藜芦醇（Ⅰ）及内标根皮素（Ⅱ）结构

1.2 动物及给药方式比格犬（10±3）kg，雌雄各半，白藜芦醇给药剂量为300mg/kg，给药方式为口服。

1.3 仪器Agilent 1100液相色谱仪（Agilent 1100泵、Agilent1100 DAD检测器、Agilent 1100色谱工作站）；电子分析天平（德国Sartorius公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：UltimateAQ-C18（150mm×4.6mm，5μm，Welch Materials.Inc.，USA）；C18保护柱（10mm×4.6mm，江苏汉邦）；流动相：乙腈∶水=32∶68（v/v）；流速：1ml/min；检测波长：306 nm，进样量：20μl，柱温：30℃。

2.2 标准溶液及内标溶液配制精密称量白藜芦醇对照品5.00mg，于50ml棕色容量瓶中以甲醇溶解并释至刻度，摇匀，制成对照品储备液，-20℃避光保存备用。

精密称量根皮素对照品50.00mg，于50m l容量瓶中以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品储备液，-20℃避光保存备用。

2.3 血浆样品预处理取比格犬血浆0.2 ml于1.5 ml离心管中，加10μl内标物根皮素（640μg/ ml），涡旋振荡30 s，加1ml乙酸乙酯，涡旋3min。12000 rpm×10min离心，取上清液800μl，通风橱中氮气流吹干，加甲醇80μl，涡旋振荡3min，12000 rpm× 10min离心，取上清液20μl进行HPLC分析。

2.4 方法的专属性取比格犬空白血浆0.2ml，按“血浆样品预处理”；将一定浓度的白藜芦醇标准溶液和内标溶液加入空白血浆中，同法操作；取比格犬口服给药后收集的血浆样品，同法操作。按“色谱条件”中的色谱条件下进样分析，结果显示，空白血浆中内源性物质不干扰白藜芦醇和内标的测定，白藜芦醇的保留时间为5.2min，内标的保留时间为8.0min，见图2。

图2 白藜芦醇及内标根皮素的色谱图

2.5 标准曲线制备与线性范围精密量取白藜芦醇对照品储备液，以甲醇逐步稀释成1.0，5.5，10.0，32.5，55.0，100.0μg/ml白藜芦醇对照品溶液。

分别精密吸取上述对照品系列溶液10μl和内标溶液10μl，分别加入200μl血浆中，按“血浆样品预处理”，处理后系列标准溶液最终浓度为0.10、0.55、1.00、3.25、5.50、10.00μg/m l，取上清液20μl进行高效液相分析。

以白藜芦醇色谱峰面积（A1）与内标色谱峰面积（A2）之比Y对白藜芦醇对照品浓度C（μg/m l）进行加权最小二乘法回归，见图3。回归方程为：Y= 1.013X-0.03（R=0.9995，n=5），权重：1/C2；线性范围：0.10～10.00μg/ml。

图3 白藜芦醇标准曲线

2.6 精密度考察照标准曲线制备方法制备白藜芦醇含量为0.325μg/m l、3.250μg/m l、8.875μg/m l的血浆样品，并进行预处理。

上述各样品在各自色谱条件下同1天连续进样5次，测定峰面积，分别计算白藜芦醇的日内相对标准误差（RSD）。连续3天进样5次，测定峰面积，计算白藜芦醇的日间RSD。结果见表1。

表1 白藜芦醇测定方法精密度

2.7 提取回收率实验取比格犬空白血浆0.2m l若干份，加入10μl不同浓度的标准溶液，按“血浆样品预处理”，使白藜芦醇的浓度分别为0.325、3.250、8.875μg/ml，并进行测定。计算样品的测得浓度，与配制浓度对照，求得本法的加样回收率及准确度。见表2。

表2 血浆中白藜芦醇测定方法的提取回收率

2.8 稳定性试验总结了0.325，3.250，8.875μg/ ml三个浓度样品的稳定性数据，结果表明样品在这些实验中都很稳定，所以说明在样品常规分析中不会出现与样品稳定性有关的问题。见表3。

表3 白藜芦醇的稳定性试验

2.9 实验设计与样品采集与处理4只比格犬禁食过夜，按300mg/kg口服白藜芦醇，分别于给药后2，5，10，15，30min和1.0，1.5，2，3，4，6，8 h采血，收集于肝素化的离心管内，离心1500 rpm×10min，分离出血浆并于-20℃冻存待测。

取上述样品血浆0.2m l于1.5m l离心管中，加10μl内标物根皮素甲醇溶液（640μg/m l），涡旋振荡30 s，加1m l乙酸乙酯，涡旋3min。12000 rpm× 10min离心，取上清液800μl，通风橱中氮气流吹干，加甲醇80μl，涡旋振荡3min，12000 rpm×10min离心，取上清液20μl进行HPLC分析。

2.10 比格犬口服给药后的药代动力学比格犬口服白藜芦醇后各时间点所测得的血药浓度-时间曲线见图4。采用中国药理学会数学药理委员会编制的DAS2.0实用药代动力学软件处理血药浓度数据，求得其药代动力学参数，结果见表4。

图4 比格犬口服白藜芦醇后血药浓度-时间曲线

3 讨论

本实验建立了HPLC法测定比格犬血浆中白藜芦醇含量的方法，实验证明，本方法能够有效地测定药物在血浆中含量的变化情况及其药代动力学研究，灵敏度高，重现性好，操作简便快捷，对准确考察黄白藜芦醇对比格犬药代动力学的作用具有指导意义。

本研究表明，比格犬口服白藜芦醇后药物从胃肠道吸收快，2min即可测到原型药，15min左右血药浓度达峰值Cmax为4.789μg/m l。白藜芦醇在比格犬体内的半衰期为135min，说明本品在比格犬体内消除迅速。

表4 比格犬口服白藜芦醇后白藜芦醇的药代动力学参数

［1］Fulda S，Debatin KM.Resveratrol modulation of signal transduction in apoptosis and cell survival：A mini-review［J］.Cancer Detection and Prevention，2006，30（2）：217-223.

［2］Baur JA，Sinclair DA.Therapeutic potential of resveratrol：the in vivo evidence［J］.Nat Rev Drug Discov，2006，5（5）：493-506.

［3］Shankar S，Singh G，Srivastava RK.Chemoprevention by resveratrol：molecular mechanisms and therapeutic potential［J］.Front Biosci，2007，12（24）：4839-4854.

［4］Shakibaei M，Harikumar KB，Aggarwal BB.Resveratrol addiction：to die or not to die［J］.Mol Nutr Food Res，2009，53（2）：115-128.

［5］Lin HS，Paul C.Ho.A rapid HPLC method for the quantification of 3，5，4′-trimethoxy-trans-stilbene（TMS）in rat plasma and its application in pharmacokinetic study［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2009，49（3）：387-392.

［6］Savouret JF，Quesne M.Resveratrol and cancer：a review［J］. Biomed Pharmacother，2002，56（1）：84-87.

［7］Athar M，Back JH，Tang X，et al.Resveratrol：A review of preclinical studies for human cancer prevention［J］.Toxicology and Applied Phamacology，2007，224（3）：274-283.

［2016－05－16收稿，2016－06－14修回］［本文编辑：刘一洋］

Reverse HPLC method for the quantification of resveratrol in Beagle dog p lasma and its application in pharm acokinetic study

ZHEN Yu-gai.
Dept.of Pharmacy，No.401 Hospital of Navy，Qingdao，Shandong 260002，China

Objective To develop a HPLC-UV method for quantitative determination of resveratrol in Beagle dog plasma and to study the pharmacokinetics of resvetrol in Beagle dog after oral administration. M ethods Chromatographic separation was achieved on an Ultimate AQ-C18 column（150 mm×4.6 mm，5μm）using acetonitrile-water（32∶68，v/v）as mobile phase at a flow rate of 1.0m l/min.The UV detection wavelength was set at 306 nm，and the assay was executed at 30℃.Results The method was found to be linear in the range of 0.10-10.00μg/m l.And the main pharmacokinetic parameters of resveratrol was Cmax=4.789μg/m l，Tmax= 15min，T1/2=135min.Conclusion The above method is sensitive，simple and successfully app lied in the study of pharmacokinetics of resveratrol in Beagle dog plasma which resveratrol was absorbed and eliminated quickly.

Resveratrol；Pharmacokinetics；Beagle dog；Reverse HPLC

R917

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.01.020

260002山东青岛，解放军401医院（甄玉改）