两步法高效制备玉米芯木寡糖的工艺研究

朱振元，李起祥，潘立超，葛晓冉

（1.天津科技大学新农村发展研究院，天津300457；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

两步法高效制备玉米芯木寡糖的工艺研究

朱振元1，2，李起祥1，潘立超1，葛晓冉1

（1.天津科技大学新农村发展研究院，天津300457；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

以玉米芯为原料，通过碱提醇沉法和酶水解法两步高效提取制备木寡糖。玉米芯成分分析结果表明，玉米芯中水分含量为（12.06±1.23）%，粗纤维含量为（43.34±0.49）%，粗灰分含量为（1.87±0.03）%，脂肪的含量为（0.67±0.02）%，可溶性蛋白质含量为（0.07±0.01）%，可溶性糖含量为（0.34±0.01）%，还原糖含量为（0.13±0.01）%，木质素含量为（28.47± 0.87）%。通过单因素和正交试验确定了碱提醇沉法提取玉米芯木聚糖粗品的工艺为：提取温度85℃，碱质量分数15%，料液比1∶15（g/mL），提取时间150min，该工艺条件下木聚糖得率为12.44%。通过正交试验确定了酶解制备木寡糖的最佳工艺条件为底物浓度40g/L，酶含量0.02%，反应时间4h。在此条件下酶解制备木寡糖相对含量为89.61%。

玉米芯；木寡糖；碱提醇沉法；酶水解法

木寡糖（XOS）是由木聚糖分解，以木糖分子为基本单元通过糖苷键结合组成的混合物，经过内切木聚糖酶酶解，然后经分离和精制而制得的[1]。它可以选择性地促进肠道双歧杆菌的增殖活性。目前应用十分广泛，包括医药保健品类，如治疗肠胃功能失调、糖尿病、高血压等；乳品饮料类，如奶粉、酸奶、碳酸饮料等；食品类：如调味品、甜品点心、罐头。低聚木糖的制备方法，主要有热水抽提法、酶水解法、碱水解法、酸水解法和微波降解法等。

我国玉米芯产量巨大，长期以来玉米芯处理不当，浪费巨大。而玉米芯含有的木聚糖，可以用来制备低聚木糖。目前玉米芯低聚木糖的制备已有一些研究，孙军涛等[2]用酸-复合酶法制备玉米芯低聚木糖；宋娜等[3]对微波处理玉米芯制备低聚木糖进行研究；孙军涛等[4]用超声波辅助复合酶法制备玉米芯低聚木糖。本文采用稀碱法，高温处理玉米芯，优化玉米芯的预处理，提取玉米芯木聚糖，再采取酶法处理的方式，得到玉米芯木寡糖。

1 材料与方法

1.1 原料与设备

玉米芯：由山东龙力生物技术有限公司提供，保藏温度为室温。

无水葡萄糖、苯酚、浓硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾、浓盐酸、无水乙醇：以上试剂来自天津市北方天医化学试剂厂；牛血清蛋白：上海蓝季科技公司；考马斯亮蓝：Amresco；G-250氯仿：天津市风船化学试剂厂；试剂均为分析纯，市售。

SP2102UV型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DF-101S集热式恒温磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限公司；LD4-40型低速大容量离心机：北京医用离心机厂；SRJX-4-9马弗炉：天津市继红五金机电厂；LGJ-0.5台式冷冻干燥机：军事医学科学院实验仪器厂；索氏提取器：天津北方科教仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米芯成分分析

玉米芯是玉米果穗脱去子粒后的穗轴，一般占玉米穗20%～30%左右。水分含量利用直接干燥法进行试验[5]；粗纤维含量利用消煮法进行试验[6]；粗灰分含量利用马弗炉灰化法进行试验[7]；脂肪含量利用索氏提取法进行试验[8]；可溶性蛋白含量利用考马斯亮蓝法测定玉米芯粉中可溶性蛋白质的含量[9]；可溶性糖含量利用苯酚-硫酸法测定可溶性糖含量[10]；还原糖含量利用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量[11]；木质素含量利用Klason法进行试验[12]。

1.2.2 玉米芯木聚糖的提取

1.2.2.1 单因素试验

提取温度：称取粉碎好的玉米芯粉10 g，固定料液比1∶15（g/mL）、提取时间90min、乙醇终浓度70%，观察提取温度（70、75、80、85、90℃）对木聚糖得率的影响。

料液比：称取粉碎好的玉米芯10 g，固定提取温度85℃、提取时间90min、乙醇终浓度70%，观察料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]对木聚糖得率的影响。

提取时间：称取粉碎好的玉米芯10 g，固定提取温度85℃、料液比1∶15（g/mL）、乙醇终浓度70%，观察提取时间（60、90、120、150、180min）对木聚糖粗品的影响。

碱质量分数：称取粉碎好的玉米芯10 g，固定提取温度85℃、料液比1∶15（g/mL）、提取时间90min，观察碱质量分数（5%、10%、15%、20%、25%）对木聚糖得率的影响。

在单因素试验的基础上，对提取温度、料液比、提取时间和碱质量分数进行四因素三水平L9（34）正交试验，以玉米芯木聚糖得率为指标，确定最佳提取条件。正交试验因素水平如表1所示。

表1 正交试验因素水平表Table1 Levelsand factors tableoforthogonalexperiment

1.2.2.2 酶解木聚糖制备木寡糖

1）木聚糖酶活的测定[13]

利用DNS法测定木聚糖酶的活力。

2）低聚木糖的HPLC分析

采用HPLC分析[14]酶解制备的低聚木糖组成。

3）样品处理[15]

将低聚木糖用流动相配成5 mg/mL的溶液，经0.22μm有机微孔滤膜过滤，超声脱气，取20μL滤液进行分析。

4）标准液配制

用流动相分别配制5mg/mL的木糖、木二糖、木三糖对照品标准溶液，过0.22μm滤膜，超声脱气备用。

5）色谱条件

安捷伦-1200型高效液相色谱仪；色谱柱：APS-2 HYPERSIL；柱温：30℃；流动相：乙腈-水（75∶25，体积比），混匀，使用前超声脱气；流速：0.8mL/min；进样量：20μL；检测器：示差检测器。

1.2.3 木聚糖酶酶解试验

1.2.3.1 酶解试验

对木聚糖酶浓度（单位：h；A处理）和反应时间（单位：h；B处理）进行酶解试验。试验因素水平表见表2。

表2 酶解试验表Table2 Levelsand factors tableofexperiment

1.2.3.2 验证试验

采用酶解试验确定的最佳条件对玉米芯木聚糖进行酶解制备木寡糖。

2 结果与讨论

2.1 玉米芯的成分分析

利用直接干燥法进行试验，经测定计算得，玉米芯粉中水分含量为（12.06±1.23）%。

利用消煮法进行试验，经测定计算得，玉米芯中的粗纤维含量为（43.34±0.49）%；由此可见，在玉米芯中粗纤维含量很高，为玉米芯的主要成分。

利用马弗炉灰化法进行试验，经测定计算得，玉米芯粉中粗灰分含量为（1.87±0.03）%。

利用索氏提取法进行试验，经测定计算得，玉米芯粉中脂肪的含量为（0.67±0.02）%。

利用考马斯亮蓝法测定玉米芯粉中可溶性蛋白质的含量经测定计算得，玉米芯粉中的可溶性蛋白质含量为（0.07±0.01）%。

利用苯酚-硫酸法测定可溶性糖含量，经计算得到玉米芯粉中的可溶性糖含量为（0.34±0.01）%。

利用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量，经计算得到玉米芯中还原糖含量为（0.13±0.01）%。

利用Klason法进行试验，经测定计算得，玉米芯粉中木质素含量为（28.47±0.87）%。

2.2 玉米芯木聚糖的提取

经单因素试验测得玉米芯木聚糖提取最佳条件：碱提取温度为90℃，料液比1∶10（g/mL），提取时间2 h，选择碱质量分数为15%。最终经正交试验测得木聚糖粗提取的最佳条件为提取温度85℃，碱质量分数15%，料液比1∶15（g/mL），提取时间150min。温度对木聚糖得率的影响见图1，料液比对木聚糖得率的影响见图2，提取时间对木聚糖得率的影响见图3，碱质量分数对木聚糖得率的影响见表4。

采用正交试验确定的最佳条件对玉米芯木聚糖进行提取，木聚糖得率达12.44%。正交表如表3、表4所示。

图1 温度对木聚糖得率的影响Fig.1 Effectof tem peratureon the yield of xylo-oligosaccharides

图2 料液比对木聚糖得率的影响Fig.2 Effectof dry/water weight ratio on the yield of crude polysaccharides

图3 提取时间对木聚糖得率的影响Fig.3 Effectof timeon theyield of crude polysaccharides

图4 碱质量分数对木聚糖得率的影响Fig.4 Effectof NaOH concentration on yield of xylooligosaccharides

表3 正交试验结果Table3 The resultsof orthogonalexperiment

表4 方差分析表Table4 Varianceanalysisof orthogonal test

2.3 酶解木聚糖制备木寡糖

2.3.1 木聚糖酶活的测定

利用DNS法测定木聚糖酶的活力，木糖的标准曲线如图5所示，回归方程为y=3.467 5x-0.034 5，R2= 0.999 0，具有良好的线性关系。经计算得到木聚糖酶酶活力为（1 631.503±5.177 9）U。

图5 木糖标准曲线Fig.5 Standard curveof xylose

2.3.2 低聚木糖的HPLC分析

木聚糖酶对木聚糖进行酶解后，采用高效液相色谱法（氨基柱）测定制备的低聚木糖的组成，由HPLC图谱可知，酶解制备的低聚木糖主要含有4种组分，其中峰1的出峰时间与木糖一致，所以峰1代表木糖。木糖标准品的高效液相色谱见图6，低聚木糖的HPLC分析图谱见图7。

2.3.3 木聚糖酶酶解试验

2.3.3.1 酶解试验

对木聚糖酶浓度（单位：%；A处理）和反应时间（单位：h；B处理）进行酶解试验，结果如表5和表6所示。

图6 木糖标准品的高效液相色谱Fig.6 High perform ance liquid chromatography（HPLC）profileof xylose

图7 低聚木糖的HPLC分析图谱Fig.7 High performance liquid chromatography（HPLC）profileof xylo-oligosaccharides

表5 试验结果Table5 The resultsof experiment

表6 木寡糖相对含量的方差分析表Table6 Varianceanalysisof orthogonal test

由极差Delta值大小可知，各因素作用主次为A＞B，表明提酶浓度对木寡糖相对含量的影响最大，其次是时间，根据每个单因素中的K值比较，以A2B2为酶解玉米芯木聚糖的最佳条件，但从经济适用角度考虑，选择酶浓度0.02%更为合适，可降低工艺成本。故酶解木聚糖制备木寡糖的最佳条件为底物浓度40 g/L，酶含量0.02%，反应时间4 h。

2.3.3.2 验证试验

采用正交试验确定的最佳条件对玉米芯木聚糖进行酶解制备木寡糖，木寡糖的得率达89.61%。

3 结论

本文对玉米芯木寡糖进行了全面的研究，对玉米芯木聚糖进行提取分离、酶解，得到如下结论。

1）通过测定可知玉米芯成分为：水分占（12.06± 1.23）%，粗纤维占（43.34±0.49）%，粗灰分占（1.87± 0.03）%，脂肪占（0.67±0.02）%，可溶性蛋白质占（0.07±0.01）%，可溶性糖占（0.34±0.01）%，还原糖占（0.13±0.01）%，木质素含量为（28.47±0.87%）。由此可见，在玉米芯中粗纤维含量很高，为玉米芯的主要成分，由其水解可获取木聚糖，故具有很大的应用价值。

2）碱提醇沉法提取玉米芯木聚糖的最佳工艺条件为提取温度85℃，碱质量分数15%，料液比1∶15（g/ mL），提取时间150min，在此条件下木聚糖粗品得率为12.44%。

3）通过酶解木聚糖制备木寡糖的工艺优化试验可以表明，最佳酶解工艺为：底物浓度40 g/L，酶含量0.02%，反应时间4 h。在此条件下酶解制备木寡糖相对含量为89.61%。

参考文献：

[1]Rosangela Garcia B,Toshiyuki Nagashima J,PraxedesK C．Preparation of micro and nanoparticles from Corncobs xylan[J]．Polymer Bulletin,2001,46：371-379

[2]孙军涛,肖付刚,李园园,等.酸-复合酶法制备玉米芯低聚木糖[J].食品科技,2014,39(11)：178-181

[3]宋娜,丁长河,李里特,等.微波处理玉米芯制备低聚木糖的研究[J].粮食加工,2006,31(5)：81-91

[4]孙军涛,张智超,王敬敬,等.超声波辅助复合酶法制备玉米芯低聚木糖[J].食品工业,2015,36(3)：37-40

[5]中华人民共和国卫生部.GB 5009.3-2010食品中水分的测定[S].北京：中国标准出版社,2010：8

[6]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB/T 6334-2006饲料中粗纤维的含量测定-过滤法[S].北京：中国标准出版社,2006：11

[7]中华人民共和国卫生部.GB 5009.4-2010食品中灰分的测定[S].北京：中国标准出版社,2010：4

[8]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB/T1477.2-2008食品中脂肪的测定[S].北京：中国标准出版社,2008：8

[10]朱加进．苦菜中可溶性多糖提取工艺研究[J]．农业工程学报,2002, 18(1)：138-141

[11]章丽华,张立平,胡锦群,等．3,5-二硝基水杨酸比色法测定红毛五加中多糖的含量[J]．中国中医药信息杂志,2008,15(5)：49-51

[12]陈为健,陈跃先,方华书,等．硫酸法测定花生壳中木质素的含量[J]．闽江学院学报,2002,23(2)：72-73

[13]杨瑞金,许时婴．中国食品添加剂．北京：中国轻工业出版社,2000：89-93

[14]张军华,徐勇,勇强,等．木二糖和木三糖的分离及其用于双歧杆菌的体外培养[J]．林产化学与工业,2005,25(1)：15-18

[15]Yoshihiro I,Naoki K,Shizuka K．Changes in fructooligosaccaride composition and related enzyme activities of burdock root during low-temperature storage[J]．Postharvest Biology and Technology, 2010,55：15-20

Studies on Extraction and Preparation of Xylooligosaccharides from Corncobs

ZHU Zhen-yuan1，2，LIQi-xiang1，PAN Li-chao1，GEXiao-ran1
（1.Institute forNeWRevelopment，Tianjin UniversityofScienceand Technology，Tianjin 300457，China；2.College of Food Engineeringand Biotechnology，Tianjin University ofScience and Technology，Tianjin 300457，China）

The extraction and preparation of xylooligosacchrides through alkaliextraction and alcohol precipitationmethod and enzymatic hydrolysis from Corncobwere studied.Firstly，the composition ofcorncobswasanalyzed.The result indicated thatmoisture，crude fiber content，crude ash content，fat content，protein content，soluble sugar content，reducing sugar content，xylogen contentof corncobswereamounted to（12.06±1.23）%，（43.34±0.49）%，（1.87±0.03）%，（0.67±0.02）%，（0.07±0.01）%，（0.34±0.01）%，（0.13±0.01）%，（28.47± 0.87）%，respectively.The extraction processing ofxylan from the corncobwasestablished through single factor experimentand orthogonal testas the followings：corncob powderwasmixed with 15%sodium hydroxide at the ratioof1∶15（g/mL）and themixturewasheated to85℃for150min.Under thiscondition，the yield of corncob xylan was12.44%.The processing parametersof xylan hydrolysisby xylanasewere optimized as the substrate concentration of40 g/L，xylanase dosage of 0.02%，hydrolysis for 4 h.Under this condition，the yield of xylooligosaccharideswas89.61%.

corncob；xylooligosaccharide；alkali extraction and alcohol precipitation method；enzymatic hydrolysismethod

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.006

2016-07-18

国家星火计划重点项目（2015GA610001）；天津市农业科技成果转化与推广项目（201502180）

朱振元（1969—），男（汉），教授，博士，研究方向：生物资源与功能食品、糖化学与糖生物学。