蓝莓提取物中功效成分含量测定方法的探讨

曾荣华，刘翠红，罗明琍，李菁，王小妹

（中药提取分离过程现代化国家工程研究中心，广州白云山汉方现代药业有限公司，广东广州510240）

蓝莓提取物中功效成分含量测定方法的探讨

曾荣华，刘翠红，罗明琍，李菁，王小妹

（中药提取分离过程现代化国家工程研究中心，广州白云山汉方现代药业有限公司，广东广州510240）

对蓝莓提取物开展原花青素，前花青素，花青素、花色苷含量测定。以保健食品中原花青素、前花青素含量测定方法及国际商务部标准测定原花青素，前花青素，花青素、花色苷含量。蓝莓提取物中测定原花青素含量是127.8%，前花青素含量是226.8%，花青素含量25.4%，花色苷含量未测出，蓝莓提取物中以花青素类含量测定方法较合适。

蓝莓提取物；原花青素；花青素

蓝莓含有大量的花色苷、类黄酮等多酚类生理活性成分，其抗氧化能力很强，具有促进视红素再合成、抗炎症、提高免疫力、抗心血管疾病、抗衰老、抗癌等多种生理功效[1]，在食品、医药、健康产品等领域中应用已经是热点和焦点之一。以蓝莓为主要原料开发的产品集中于保护视力，但是功效成分报道有以花青素、花色苷、原花青素或前花青素为功效性成分，说法各不一，未有明确功效成分指标。

花青素、花色苷属于生物类黄酮物质，花色苷是花青素接上各种糖基后的衍生物，而原花青素、前花青素是多酚类聚合物，这几种功效成分结构截然不同。本研究目的是采用原花青素方法、前花青素、花青素及花色苷方法对蓝莓中功效成分进行含量测定，以确定适宜的功效成分含量测定方法，明确蓝莓中功效成分标示。同时本研究为其它同类产品选择功效成分提供一种指标标示的参考。

1 材料

1.1 仪器与试剂

UV-2550型紫外分光光度计：日本岛津；2695型高效液相色谱仪：美国Waters公司；蓝莓提取物、原花青素对照品（纯度＞95%）：尖峰天然产物研究开发有限公司；欧洲越橘提取物对照品（批号：Y0001059）：欧洲药典；甲醇、盐酸等分析纯。

2 方法与结果

2.1 蓝莓提取物中测定原花青素含量

对照品制备方法：取原花青素对照品13.68 mg，至10 mL容量瓶中，吸取该溶液0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，各取1 mL测定。将正丁醇与盐酸按95∶5的体积比混合后，取出6 mL置于具塞锥瓶中，再加入0.2 mL硫酸铁铵溶液和1 mL对照品溶液，混匀，置沸水浴回流，精确加热40 min后，立即置冰水中冷却，在加热完毕15 min后，于546 nm波长处测吸光值。

样品制备方法：取样品50 mg置于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇超声20 min，放冷到室温后，加甲醇至刻度，摇匀，放置澄清后取上清液2 mL，用甲醇定容至25 mL。与对照品测定方法相同，由标准曲线计算原花青素的含量。蓝莓提取物中的原花青素含量测定结果见表1。

表1 蓝莓提取物中的原花青素含量测定结果Table 1 Determination of proanthocyanidins in blueberry extracts

由表1的测定数据可知：用保健食品中的测定原花青素方法测定蓝莓中的原花青素，原花青素是127.8%，远超过样品的本身含量，因蓝莓提取物溶解于甲醇中，显紫红色，而原花青素对照品甲醇溶液没有颜色，在进行紫外测定吸光值时，导致蓝莓中的原花青素测定值偏高，此方法不适合应用于有颜色的原料或产品中原花青素含量测定。

2.2 蓝莓提取物中测定前花青素含量

测定方法：保健食品中前花青素的测定[3]。

精密称定对照品10 mg原花青素标准品（因无前花青素对照品，采用原花青素对照品），用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中。

吸取该溶液0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。各取2 mL测定。

将正丁醇与盐酸按95∶5的体积比混后，取出15 mL置于具塞锥瓶中，再加入0.5 mL硫酸铁铵溶液和2 mL试样溶液，混匀，置沸水浴回流，精确加热40 min后，立即置冰水中冷却，经0.45 μm滤膜过滤后，待进高效液相色谱分析。

取样品25 mg置于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇超声20 min，放冷到室温后，加甲醇至刻度，摇匀，取1 mL至10 mL，定容。处理方法同对照品。蓝莓提取物中的前花青素含量测定结果见表2。

2.3 术前准备 术前3 d给予流质饮食。手术前晚做好肠道及术区皮肤准备，清洁灌肠、床上擦浴、供皮区及受皮区备皮。术日当天禁食。

图1 前花青素对照品液相图谱Fig.1 HPLC chromatogram of procyanidins standard

表2 蓝莓提取物中的前花青素含量测定结果Table 2 Determination of procyanidins in blueberry extracts

前花青素对照品液相图谱见图1，蓝莓提取物前花青素液相色谱图见图2。

由图1与图2可知，前花青素对照品与蓝莓提取物前花青素对照品色谱图出峰位置一致，峰形一致，是因为测定方法的原理是依据试样中前花青素单体或聚合物在加热的酸性条件和铁盐催化作用下，C-C键断裂而生成深红色花青素离子即氰定的原理，蓝莓中以花青素为主，原花青素氰定后也以花青素为存在方式，因此前花青素对照品液相图谱与蓝莓提取物液相图谱一致。但是采用此方法不能作为蓝莓提取物中的前花青素含量，由表2可知，用此方法测得的前花青素含量是226.8%，超过100%，因为蓝莓提取物甲醇溶液紫红色，存在颜色干扰，导致测定值不能反映蓝莓提取物中的前花青素含量。

图2 蓝莓提取物前花青素液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of blueberry extract

2.3 蓝莓提取物中测定花色苷含量

测定方法：越橘提取物国际商务标准[4]。

标准品溶液制备：取欧洲越橘提取物对照品125mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加2%盐酸-甲醇溶液，并稀释至刻度，摇匀。准确移取2 mL的上述溶液于10 mL量瓶中，用10%磷酸溶液定容，配成标准品溶液。

供试品溶液制备：同标准品制备。

欧洲越橘提取物对照品的花色苷液相图谱见图3，蓝莓提取物中的花色苷液相图谱见图4。

图3 欧洲越橘提取物对照品的花色苷液相图谱Fig.3 HPLC chromatogram of bilberry extract standard

图4 蓝莓提取物中的花色苷液相图谱Fig.4 HPLC chromatogram of blueberry extract

由图3及图4可知，欧洲越橘提取物对照品色谱图上超过10个色谱峰，蓝莓提取物只有两个色谱峰，且出峰时间与欧洲越橘提取物对照品出峰时间不一致，因蓝莓提取物中的花色苷与欧洲越橘提取物中的花色苷结构不一致，因此测定蓝莓提取物中的色苷不能采用此方法。

2.4 蓝莓提取物中测定花青素含量

测定方法：越橘提取物国际商务标准[4]。

精密称定供试品50 mg，置50 mL体积棕色容量瓶中，加入2%盐酸甲醇溶液30 mL，超声溶解，冷却至室温，用2%盐酸甲醇溶液定容。精密吸取2 mL至25 mL量瓶中，取5 mL到25 mL量瓶中，以2%盐酸甲醇作空白进行540 nm处测定吸光度A。蓝莓提取物中花青素的含量测定结果见表3。

3 讨论

越橘、蓝莓、黑果枸杞等水果中都有花色苷，但是花色苷种类是否一致，在对产品进行质量检测时需进一步确定。前花青素与原花青素都是黄烷醇类成分，但是目前并无有资质机构出售相应对照品，因此这两种检测方法可操作性不强。尽管现在已经有原花青素B1、B2等单体对照品，但是对照品昂贵，对于生产中实操性还存在一定的问题。花色苷只适应欧洲越橘提取物的测定，花青素测定适合性广泛，但其检测方法较粗糙，对于存在多种成分的制剂，采用此方法进行含量测定准确性需进行验证。在对花青素类产品进行功效成分含量测定时，需广泛调研文献、药典、标准及实验确证，明确原料中的功效成分衡量指标，再开展功能因子含量分析，为产品质量提供保障。

表3 蓝莓提取物中花青素的含量测定结果Table 3 Determination of anthocyanins in blueberry extracts

由表3可知，采用花青素方法，蓝莓提取物中的花青素测定结果为25.4%，与市售的25%蓝莓提取物规格一致。表明用此方法确定蓝莓提取物中花青素含量是可行的，但是此方法无对照品，对于以蓝莓提取物为主要原料开发的产品，用此方法衡量产品中花青素含量准确度欠妥。

[1] 陈介甫,李亚东,徐哲.蓝莓的主要化学成分及生物活性[J].药学学报,2010,45(4):422-429

[2]中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[M].北京:卫生部卫生法制与监督司,2003:274-275

[3] 中华人民共和国卫生部,中国国家标准化管理委员会.GB/T 22244-2008保健食品中前花青素的测定[S].北京:中国标准出版社,2008:1-3

[4]中国医药保健品进出口商会.植物提取物国际商务标准集[M].北京:中国商务出版社,2016:182-211

Investigation on Determination of Functional Ingredient in Blueberry Extract

ZENG Rong-hua，LIU Cui-hong，LUO Ming-li，LI Jing，WANG Xiao-mei
（National Engineering Research Center for Modernization of Extraction and Separation Process of TCM，Guangzhou Baiyunshan Hanfang Pharmaceutical Company Limited，Guangzhou 510240，Guangdong，China）

Determination of proanthocyanidins，procyanidins，anthocyanins and anthocyanin in blueberry extract were studied.The determinations were carried out with proanthocyanidins and procyanidins'content methods of function food and National Ministry of commerce standard.Content of proanthocyanidins was 127.8% ，content of procyanidins was 226.8%.Content of anthocyanins was 25.4%.Anthocyanin content was not measured.Determination of anthocyanins was suitable for blueberry extract.

blueberry extract；proanthocyanidins；anthocyanins

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.029

2016-08-15

广东省科学技术厅应用型科技研发专项资金项目（2015B020234001）

曾荣华（1978—），女（汉），工程师，硕士，从事健康产品研究。