粪便SPG20、FBN1及VIM基因启动子甲基化联合检测在结直肠癌诊断中的意义*

尹建浩,张 昊,孟 磊,许 刚,周章建,张 勇,党诚学

西安交通大学第一附属医院肿瘤外科(西安 710061)

粪便SPG20、FBN1及VIM基因启动子甲基化联合检测在结直肠癌诊断中的意义*

尹建浩,张 昊,孟 磊,许 刚,周章建,张 勇,党诚学△

西安交通大学第一附属医院肿瘤外科(西安 710061)

目的：探讨粪便标本的痉挛性截瘫-20(SPG20)、微纤维蛋白-1(FBN1)及波形蛋白(VIM)基因启动子甲基化联合检测在结直肠癌诊断及筛查中的意义。方法：选取结直肠癌患者75例为观察组，30例健康、年龄匹配的经结肠镜检查阴性者为正常对照组。提取组织及粪便标本DNA，应用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)方法检测组织及粪便标本中SPG20、FBN1及VIM基因启动子甲基化状态。结果：结直肠癌患者癌组织中SPG20、FBN1及VIM基因启动子甲基化显著高于远癌组织；结直肠癌患者粪便中SPG20、FBN1及VIM基因启动子甲基化显著高于健康对照人群。联合检测显示，96%的患者表现为至少有一个基因启动子区呈现异常的甲基化状态，而在健康人群中，仅有4个(13.3%)呈现基因的异常甲基化状态。因此应用SPG20、FBN1、VIM三个基因启动子区甲基化状态对结直肠癌患者进行筛查的敏感性为96.0%，特异性为86.7%。结论：粪便标本的SPG20、FBN1及VIM基因启动子甲基化联合检测在结直肠癌的诊断和筛查中具有重要的应用价值。

结直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一[1]，晚期结直肠癌患者5年生存率不足10%，而早期患者在90%以上，因此早期筛查能够提高结直肠癌患者的治愈率[2-3]。肠镜检查虽具有较高准确性，但由于肠道准备、检查不适、费用较高等因素导致接受度较差。粪便隐血试验简单易操作，费用低，但敏感性及特异性均低，在结直肠癌筛查中的意义有限。所以，发展易操作、高敏感性和特异性的癌筛查手段十分必要。

痉挛性截瘫-20(Spastic paraplegia-20,SPG20)基因编码一种被称作Spartin的多功能蛋白质，此蛋白可能参与胞内表皮生长因子的接受与运输，研究显示在结肠癌细胞中该基因启动子区域呈现异常高甲基化状态[4-5]。微纤维蛋白(Fibrillin-1,FBN1)基因编码的蛋白是Fibrillin家族成员之一，该基因在结直肠癌细胞中也表现启动子高甲基化状态[5]。波形蛋白(Vimentin,VIM)基因编码的波形蛋白属中间纤维家族，在细胞粘附、迁移、增殖、凋亡、信号传导及炎症发生等多方面起着重要作用[6]。

在本研究中, 我们采用MSP方法, 联合检测结直肠癌患者的肿瘤组织、正常组织标本中，结直肠癌患者和正常人粪便标本中SPG20、FBN1、VIM基因启动子甲基化状态并分析，探讨甲基化联合检测在结直肠癌筛查方面的临床意义。

材料和方法

1 材 料 选取就诊于西安交通大学医学院第一附属医院的结直肠癌患者75例为观察组。同期，选取西安交通大学医学院第一附属医院体检中心进行体检的30例健康、年龄匹配的经结肠镜检查阴性者为健康对照组，粪便标本于内镜检查前收集。结直肠癌患者的癌组织、远癌组织标本，粪便标本收集分装后迅速置于液氮中保存。

2 研究方法

2.1 组织DNA提取：取约20 mg组织标本，按血液组织细胞基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，中国)说明书提取组织基因组DNA，提取出来的基因组DNA保存于200 μl的TE洗脱缓冲液中，并置于-20℃冰箱中保存。

2.2 粪便DNA提取：取约200 mg粪便标本，按QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen，德国)说明书提取粪便基因组DNA，提取出来的基因组DNA保存于200 μl的AE洗脱缓冲液中，并置于-20℃冰箱中保存。

2.3 DNA的重亚硫酸盐修饰：取1μg基因组DNA，使用Epi-Tect Bisulfite Kit(Qiagen，德国)试剂盒进行基因组DNA的重亚硫酸盐修饰和纯化。产物迅速进行下游实验。

2.4 MSP扩增：MSP反应体系总体积为25 μl： 重亚硫酸盐修饰后的基因组DNA样品3 μl，2×HotStart Taq MasterMix(天根生化科技有限公司，中国)12.5 μl，无菌水7.5 μl, dNTP 1 μl, 25μM的上、下游引物各1 μl。MSP反应条件：第1步，94℃预变性3min；第2步，94℃ 30s，相应退火温度30s，72℃ 30s，共40个循环；最后，72℃延伸5min。将5 μlMSP产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳。

3 统计学方法 各项数据结果应用SPSS 19.0分析软件进行处理，各组间比较采用t检验，阳性率比较采用卡方检验或Fisher确切概率检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 结直肠癌组织中SPG20、FBN1、VIM基因启动子区甲基化状态 结直肠癌患者癌组织标本及远癌组织标本中，SPG20、FBN1、VIM基因启动子区甲基化发生率显著高于远癌组织(P<0.001，表1)。进一步对结直肠癌患者按年龄、性别、肿瘤部位、病理分期等因素进行分层分析，结果显示，SPG20、FBN1、VIM基因启动子区甲基化发生率在不同年龄、性别、病理分期下无显著差异。

2 粪便标本中SPG20、FBN1、VIM基因启动子区甲基化状态 结直肠癌患者及健康对照人群粪便标本进行基因启动子区甲基化检测，结果显示，结直肠癌患者粪便标本中SPG20、FBN1、VIM基因启动子区甲基化发生率显著高于健康对照人群(P<0.001，表1)。进一步对结直肠癌患者按年龄、性别、肿瘤部位、病理分期等因素进行分层分析，结果显示，粪便标本中SPG20、FBN1、VIM基因启动子区甲基化发生率在不同年龄、性别、病理分期下无显著差异。

表1 组织及粪便标本中SPG20、FBN1及VIM基因甲基化状态

注: M:甲基化状态, U:非甲基化状态

3 联合检测在结直肠筛查中的效率 应用粪便标本中SPG20、FBN1、VIM三个基因启动子区的甲基化状态对结直肠癌患者进行联合评估，当有一个基因启动子呈现甲基化既判定为阳性。综合对所有结直肠患者及健康对照人群进行分析，结果显示，96%的患者表现为至少有一个基因启动子区呈现异常的甲基化状态，而在健康对照人群中，仅有4个(13.3%)呈现基因的异常甲基化状态。因此应用SPG20、FBN1、VIM三个基因启动子区甲基化状态对结直肠癌患者进行筛查的敏感性为96.0%，特异性为86.7%。

讨 论

中国结直肠癌中有50%的患者在手术后5年会发生转移和复发[7]，我国结直肠癌的发病率正逐年上升，且流行病学亦呈现部分与西方发达国家相类似的特征，早期筛査对发现癌前病变和早期癌症具有重要意义。粪便中肿瘤标志物的检测作为结直肠癌患者的筛查手段已经越来越受到国内外科研或临床工作者的重视，也因其非侵入性、易操作性和费用低而易于被受试人群所接受。某些基因在肿瘤组织和正常组织甲基化程度存在明显的差异，并在肿瘤发生发展过程中脱落随粪便排出，这为粪便中基因甲基化检测应用于结直肠癌筛查提供了可能[8]。然而不同抑癌基因启动子在结直肠癌患者中的甲基化发生率差异较大，并且由于样本量、检测手段等因素的影响，同一基因在不同的研究中表现出的灵敏度和特异度也存在一定的差异，作为疾病筛查手段，尤其是针对恶性肿瘤这类疾病，足够的敏感度和特异度是非常重要的[9]。

在本研究中，我们分别检测了结直肠癌患者的肿瘤组织、正常组织标本中，结直肠癌患者和正常人粪便标本中SPG20、FBN1、VIM基因启动子甲基化状态，结果表明三者在肿瘤组织中甲基化发生率与远癌组织相比均存在显著性差异，并且在结直肠癌患者的粪便中基因启动子异常甲基化状态的检出率显著高于健康对照人群。

同时通过基因联合检测的结果可知， SPG20、FBN1、VIM三个基因启动子区甲基化状态对结直肠癌患者进行筛查的敏感性为96.0%，特异性为86.7%。这表明联合检测基因甲基化的敏感性较单基因检测有所提高，但特异性将降低。另外，粪便中三个基因甲基化状态与患者的性别、年龄、肿瘤TNM分期无相关性，因此，联合检测不仅能够发现晚期的结直肠癌患者，同时也不会漏诊早期患者，这对肿瘤疾病的早期发现、早期诊断、早期治疗具有重要的意义。

因此，粪便标本中SPG20、FBN1、VIM基因启动子甲基化联合检测分析可能成为结直肠癌患者无创筛查的一项重要的、可行的方法。

[1] Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R,etal. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. International Journal of Cancer, 2015, 136(5): E359-E386.

[2] Siegel R, Ward E, Brawley O,etal. Cancer statistics, 2011: the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J]. CA Cancer J Clin , 2011,6l(4): 212-236.

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[4] Bakowska JC, Jupille H, Fatheddin P,etal.Troyer syndrome protein spartin is mono-ubiquitinated and functions in EGF receptor trafficking[J]. Molecular Biology of the cell,2007，18: 1683.

[5] Lind G, Raiborg C, Danielsen S,etal. SPG20, a novel biomarker for early detection of colorectal cancer,encodes a regulator of cytokinesis[J]. Oncogene,2011,30: 3967.

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[8] Ahlquist DA, Shuber AP. Stool screening for colorectal cancer: evolution from occult blood to molecular markers[J]. Clinica Chimica Acta, 2002, 315(1): 157-168.

[9] Toiyama Y, Okugawa Y, Goel A. DNA methylation and microRNA biomarkers for noninvasive detection of gastric and colorectal cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun,2014,455(1-2): 43-57.

(收稿：2016-10-17)

Detection of hypermethylated SPG20, FBN1 and VIM in stool samples of patients with colorectal cancer

Yin Jianhao , Zhang Hao,Meng Lei,et al.

Department of Surgical Oncology, First Affiliated Hospital, Xi’an Jiaotong University College of Medicine ( Xi’an 710061)

Objective: To clarify the feasibility and clinical significance of detection of SPG20, FBN1 and VIM gene promoter hypermethylation in stool samples of patients with colorectal cancer. Methods: Samples were collected from 75 patients with colorectal cancer and 30 healthy individuals in the first affiliate hospital of Xi’an Jiaotong University. The methylation status of SPG20, FBN1 and VIM gene promoter in tissue and stool samples was detected using methylation-specific PCR. Results: The methylation rates of SPG20, FBN1 and VIM gene promoter in cancer tissue samples were significantly higher than the distal tissue samples in patients with colorectal cancer. Also, the methylation rates of SPG20, FBN1 and VIM gene promoter in stool samples of patients with colorectal cancer were significantly higher than the healthy individuals. The sensitivity and specificity of combined detection of SPG20, FBN1 and VIM gene promoter methylation status in stool samples in detecting colorectal cancer were 96.0% and 86.7%, respectively. Conclusions: Multi-targets detection of SPG20, FBN1 and VIM gene promoter methylation status in stool samples is a promising approach in the screening of colorectal cancer.

Colorectal Neoplasms Methylation @SPG20 @FBN1

*国家自然科学基金资助项目(NSFC81372280)

结直肠肿瘤 甲基化 @痉挛性截瘫-20 @微纤维蛋白-1

R735.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.04.002

△通讯作者