ELISA法在植物检测中的应用研究及改进措施

张黎凤++马天文++曹海艳

摘要 酶联免疫吸附法（ELISA）目前是酶联免疫技术中应用最广的方法。详细分析了ELISA的基本原理，并对其基本类型及在植物病毒检测中的应用现状进行了研究。最后在理论分析的基础上结合工作经验，从提高ELISA的灵敏度、保持ELISA检测的稳定性、特异性、检测的标准曲线方法等方面提出改进策略，并对其发展前景进行展望。

关键词 酶联免疫吸附法；植物病毒检测；灵敏度；改进策略

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）24-0137-02

早期植物病毒病的检测一般采用传统的生物学方法，而这种单一的生物学检测病毒的方法需要耗费大量的人力和物力，必须培育大量的接种植物，此法不仅费工费时，而且病毒症状表现的时间也较长。因此，寻找灵敏度高、快速、可靠的植物病毒病检测方法迫在眉睫。自从扇叶病毒向草本寄主转接获得成功后，免疫学技术开始蓬勃发展。免疫学技术包括细胞免疫技术、免疫制备技术、免疫血清学技术，其中以血清学技术应用的最为普遍。血清学方法检测植物病毒是利用血清反应原理实现的。由于每一种植物病毒产生的抗血清都有各自的特性，因此通过已知病毒的抗血清可鉴定病毒种类。酶联免疫吸附法（ELISA）是血清学技术中应用最为广泛的一种方法，并已渗透到各个研究领域，该方法是以酶催化的颜色反应来指示抗原抗体的结合[1-2]。由于其具有灵敏、快速、特异性强、分析率高、花费少等优点，可用于大规模样品调查，因此成为检测植物病毒的关键技术。

1 酶联免疫吸附法的基本原理

ELISA的基本原理是将酶标记同抗原或抗体物理性地吸附于固相载体表面与酶的催化作用结合，并保持其免疫活性。酶标记的抗原或抗体既保留其反應的特异性，又保留了酶的活性。在测定时，ELISA用固相载体吸附抗原或抗体，固相载体上形成的抗原抗体复合物通过洗涤的方式与液体中的其他物质分开，再加入通过酶标记反应而结合在固相载体上的抗原或抗体，酶结合物与相应的抗原或抗体结合后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，此时待测抗原或抗体与有色产物的量呈一定的比例[3-4]。故可根据底物显色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法具有很高的敏感度。

2 酶联免疫吸附法的基本类型

ELISA目前是酶联免疫技术中应用最广的技术。ELISA既可以用来测定抗原，也可以用来测定抗体。在使用酶联免疫吸附法测定时必须具有3种试剂，即固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）、酶标记的抗体或抗原（结合物）、酶作用的底物。从酶联免疫技术建立开始，经过不断的改进，已形成了各种不同类型的检测方法。常用的方法有双抗体夹心法、竞争法和间接法等。这些方法的灵敏度较高、特异性强，已广泛用于病毒的检测。

2.1 双抗体夹心法测抗原

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，适用于检测多价抗原。样品中的被检测抗体分子分别与固相载体上的抗原和酶标记的抗原相结合。包被特异性抗体与固相载体连接，经洗涤加入含抗原的待测样品使其与过量固相抗体结合，保温反应，形成复合物。再加入酶标记特异性抗体，保温反应。抗原与酶标记特异性抗体在固相复合物上相结合，洗涤未结合的。加入底物显色，酶催化底物显色，根据显色程度，求出样品中抗原的量（图1）。

2.2 竞争法测抗原

小分子抗原可以采用竞争法检测抗原。特异性抗体吸附到固相载体的表面，经过洗涤后分为a/b 2种情况：a组加酶标记抗原和被测抗原混合物，经过温育洗涤后加入底物显色；b组仅仅加入酶标记抗原，经过温育洗涤后加入底物显色。a/b 这2组底物降解量的差就是所要测定的抗原的量（图2）。

2.3 间接法测抗体

间接法测抗体也是常常采用的方法之一，酶标记抗体检测各种与抗原相应的抗体。特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原。包被抗原经过洗涤加含有抗体的样品温育反应，再洗涤后加入酶标记抗体，温育洗涤后，加入底物显色（图3）。

3 酶联免疫吸附法的应用

伴随与其他学科新技术的融合和其本身具有的优点，ELISA得以广泛的应用。ELISA可以用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定溶液中的可溶性抗原。目前，国内外在ELISA 检测植物病毒方面做了大量的研究工作。

ELISA在植物病毒中的应用：ElISA技术具有专属性很强的特点，不仅可以测定不同病毒之间的亲缘关系及株系关系，鉴别亲缘关系很近的病毒，还可以对同一种病毒的不同的血清类型区分，有助于测定病毒株系和血清型的分化；可研究植物变异株系的分布情况对植物病毒的流行病学进行研究；ELISA病毒检测是实现无毒化栽培的关键，可以通过对样品的初步检测，筛选脱毒苗木；ELISA可检测植物的真菌和细菌；检测种子的健康，由于灵敏度比较高，可以测定单个种子中的植物病毒抗原，还可以检测未发芽种子内的某一微小部分如种皮、种胚、胚乳上的病毒，提供快速、准确的种子质量认证和植物检疫认证，与传统培养方法相比节约了大量的时间、人力和物力；可以大规模检测果树、葡萄、草莓等经济作物中的病毒；检测传播介体、土壤、播种工具中的植物病毒，对病情的预防和及时采取防治措施都有重要的影响；可以检测自然寄主中的植物病毒；分子生物学中进行样品的筛选，可以用ELISA区分阴阳性样品，再用PCR进一步判断。

4 酶联免疫吸附法的改进提高

4.1 提高ELISA检测灵敏度的方法

酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，ELISA样品的前处理在检测中处于重要地位。不同的前处理方式对检测会产生不同的结果[5]。以植物样品为例，选取不同的阴性对照、阳性对照和抗血清浓度都会影响到检测结果。病毒的检测不仅要选择合适的检测方法，而且样品的取样部位和取样时间都会影响检测结果的准确度。因此，在ELISA分析中样品的前处理至关重要。根据不同的待测样品，选取与之适合的前处理方式是建立高灵敏度的检测方法的首要条件。

抗原、抗体的固相化在ELISA检测系统中有着重要的地位，亲和力常数越高，ELISA方法灵敏度就越高。抗原、抗体的固相化是固相免疫测定的前提。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，物理吸附技术是一种简单的固定技术，但在此过程中会发生折叠，惰性蛋白封闭剂会遮蔽功能部位，进而影响了生物分子的功能，检测的灵敏度就会受到影响。化学共价偶联方法比物理吸附方法的固定强度高、特异性好，可以提高ELISA检测的灵敏度。提高ELISA检测的灵敏度需要采取合适的方法制备出亲和力强的抗体，先进的固相化技术，为抗原或抗体提供适当的环境[6-7]。

4.2 保持ELISA检测的稳定性

稳定剂一般由蛋白质、缓冲液、糖类、防腐剂和其他一些能够起稳定作用的物质组成。商业化免疫检测试剂的酶结合物稳定剂大多不公开，性能也存在着一定的差异，开发出性能较好的酶结合物稳定剂，是维持免疫检测稳定性的关键环节。

4.3 确保ELISA检测的特异性

在选择ELISA检测方法的抗体时，应该避免选用交叉反应严重的抗体以确保检测的特异性。在保证检测灵敏度的前提下，调整好合适的酶浓度控制好检测背景，可确保ELISA检测的特异性。

4.4 ELISA检测的标准曲线

ELISA操作步骤繁复，影响试验结果的因素较多，固相介质表面的吸附能力和抗原、抗体之间的相互作用是直接影响ELISA检测结果的关键性因素。因此在定量测定时，不同的样品用不同浓度的参考标准品在同等条件下制定标准曲线，择适当的检测区域。

一般的信号系统是通过酶催化底物显色，通过显色的情况对被检测的物质进行分析。一些微量待测物质在样品中的含量比较低，在样品的前处理过程中可能存在提取不徹底等原因，致使ELISA的信号系统对待测物不能准确的定量。可通过使用信号放大系统进行修正。合理的信号放大有利于提高ELISA检测的灵敏度。

5 展望

ELISA方法具有选择性好、灵敏度高、设备价格便宜、折旧损耗小等请多的优点，在人类、动物、植物、微生物、环境检测等领域都有广泛的应用。但是ELISA技术也有其局限性和不足。而生物技术发展迅速，如dsRNA分析、分子杂交、PCR等分子生物学技术的发展应用，使得病毒检测的方法得到补充和完善。相信在各个领域里会有广泛的应用前景。

6 参考文献

[1] 于绍夫.酶联免疫吸附测定法检测果树病毒研究进展[J].落叶树，1995（2）：9-22.

[2] 青玲，刘映红，马丽娜，等.武隆烟区烟草病毒病的病原初步鉴定[J].西南农业大学学报，2005，27（3）：220-221.

[3] 焦奎，张书圣.伏安酶联免疫分析及其在植物血清学检测技术中的应用[J].化学通报，2000，64（10）：50-54.

[4] 魏梅生.植物无性种质材料中病毒的检测与治疗[J].世界农业，1995（10）：30-33.

[5] 陈建军，李培睿，杨向英，等.DAS-ELISA和PAS-ELISA检测GFLV的技术研究[J].河南农业科学，2004（11）：48-51.

[6] DONG N，DONG J，LIU P，et al.Effects of anticoagulants on human pla-sma soluble corin levels Measured by ELISA[J].Clin Chim Acta，2010， 411（23-24）：1998-2003.

[7] JONE R A C，TORRANCE L.Developments And Applications In Virus Testing[M].Wellosboume，Lavenham Press，1986.