应用实时荧光定量PCR法进行急性呼吸道传染病病原的筛查分析

杨国松

摘要：目的 对于实时荧光定量PCR法在急性呼吸道传染病病源筛查中的应用情况进行分析研究。方法 选取2015年6月～2016年6月在我院进行治疗的发热伴呼吸道症状患者130例作为本次研究对象，对130份发热伴呼吸道症状病例咽拭子标本，采用实时荧光定量PCR法实施五类常见呼吸道病毒和其亚型的检测以及鉴定，并分析在急性呼吸道传染病病原筛查中应用实时荧光定量PCR法的意义。结果 在对130份咽拭子标本实施实时荧光定量PCR法进行分析实验以后，共筛查出甲型流感病毒阳性标本66份（50.77%），乙型流感病毒阳性标本8份（6.15%），腺病毒阳性标本4份（3.08%），并未检出呼吸道合胞病毒、副流感病毒以及冠状病毒。结论 应用实时荧光定量PCR法在急性呼吸道传染病病原的筛查中，可以发挥出快速准确以及较强特异性的优势，对急性呼吸道传染病的预防和控制具有重要的预测作用。因此，值得将此种方式在临床急性呼吸道传染病病源筛查中广泛的应用实践。

关键词：实时荧光定量PCR法；急性呼吸道传染病；病源筛查；应用

呼吸道传染病的流行具有隐蔽性以及突发性，其传播的途径较多，可以在人-人、人-动物、动物-动物之间进行传播。生活中，呼吸道传染病的活动性较大，同时较为集中，一旦产生呼吸道传染病，就会对人们的正常生活以及工作造成严重的影响，降低生活质量，严重者可对生命安全造成直接威胁。根据相关的研究资料结果显示，急性呼吸道感染具有超过百分之九十的比例是因为病毒所导致，并且最常见的就是呼吸道病毒，所以采取科学有效的管理以及防控举措尤为重要。本研究将实时荧光定量PCR法应用于急性呼吸道传染病病源筛查中，观察及分析了应用的效果，报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 对2015年6月～2016年6月的130例发热伴呼吸道症状患者采集的咽拭子标本进行筛查分析。标本源均排除其他流行病学接触史，年龄在20～65岁，平均年龄（42.6±1.2）岁，其中78个标本源自男性患者，52个标本源自女性患者。

1.2方法 本研究应用的仪器实时荧光定量PCR扩增仪为美国ABI公司 7500，试剂为赛默飞世尔公司 PureLinkTMViral RNA/DNA Mini Kit 病毒核酸提取试剂盒。TaKaRa 公司的One Step PrimeScript TM RT - PCR Kit扩增试剂盒，其扩增用的引物、探针序列得到WHO的推荐，并且为引物合成公司合成[1]。

首先，对严格遵循无菌技术从发热病例采集的咽拭子标本做好标识并详细记录；其次，实施核酸提取。应用核酸提取试剂盒于洁净区内二级生物安全柜内实施标本RNA的提取；最后展开呼吸道病毒的筛查和鉴定，具体如下：①反应体系和处理：严格遵循试剂盒的说明书要求进行试剂准备，并且待测的标本均分别检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒以及呼吸道合胞病毒、副流感病毒、冠状病毒。将处理好的待测样本RNA 4 μl加入到事先准备好的反应液内，各反应板做好质控对照，并每批次设置一组阳性对照，以及各份样品都实施内参对照的设置[2]。制定检测管终体积在20 μl，于盖紧管盖以后进行混匀和瞬时低速离心；②基因扩增：于扩增仪上，展开实时荧光定量PCR反应，设定扩增循环参数为：以42 ℃、5 min，95 ℃、10 s，1个循环作为第一阶段，并实施逆转录反应；以95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，40个循环作为第二阶段，并展开PCR扩增反应。于60 ℃期间，对荧光进行采集，羧基荧光素通道为检测通道，在进行加样以后再上机实施PCR扩增反应[3]；③分析结果：在反应结束后，实时荧光定量PCR扩增仪会显示各个样品0～40个循环数内的相对荧光强度曲线图，针对图像调节扩增基线的起始值以及终止值和阈值（Ct）进行分析，如果Ct值在37.0或者以下，则反应呈现出阳性结果，如果不具有Ct值、Ct值等于0，则反应呈阴性，灰区的标准为Ct值在37.0～40.0。在点击Analysis后，仪器进行结果分析并显示分析结果的报告页面。

2 结果

在实施检测以后，在130份发热伴呼吸道症状的咽拭子标本中，共检测到了共筛查出甲型流感病毒阳性标本66份（50.77%），乙型流感病毒阳性标本8份（6.15%），腺病毒阳性标本4份（3.08%），并未检出呼吸道合胞病毒、副流感病毒以及冠状病毒。

3 讨论

由病毒所导致的急性呼吸道感染，病毒感染的临床症状具有相似的表现，并且有些病毒常常容易导致世界范围内的大流行，其中呼吸道病毒感染更是容易引发较高死亡率[4]。所以，做到及时准确的识别呼吸道传染病病原体，做到有效防控疾病传播，对于患者的诊疗以及提升生存质量具有重要意义。

荧光定量PCR技术具有独特的优势，包含DNA探针杂交技术以及PCR两种技术，能够经PCR荧光信号变化情况、PCR反应酶动力学特点，针对DNA模版获得精准的定量测定。荧光定量PCR运转具有较为封闭的环境，能够精简PCR后处理以及电泳检测环节，所以此种情况也有效避免了产物扩增导致污染以及PCR不能够定量测定和复杂的操作程序等问题[5-6]。

熒光定量PCR技术具有较高的特异性、操作便捷、能够应用特定低纯度标本，同时灵敏度较高，将现有技术不能够解决的缺陷有效克服，所以应用的意义巨大。在本研究中，对130份发热伴呼吸道症状的病例标本应用实时荧光定量PCR法进行呼吸道病毒的筛查和鉴定，结果显示在所有研究对象的咽拭子标本中，共检测到了共筛查出甲型流感病毒阳性标本66份（50.77%），乙型流感病毒阳性标本8份（6.15%），腺病毒阳性标本4份（3.08%），并未检出呼吸道合胞病毒、副流感病毒以及冠状病毒。结果充分表明，实时荧光定量PCR法对于急性呼吸道传染病病原活动水平可获得有效掌握，也因此为患者得早期防控提供了坚实的依据，推广应用价值较大。

综上所述，应用实时荧光定量PCR法筛查急性呼吸道传染病病原具有重要的作用，筛查期间可发挥优势具有速度快、准确度高、特异性强等，所以能够于实践防控急性呼吸道传染病中起到重要的应用价值，值得大量推广使用。

参考文献：

[1]庞中强.实时荧光定量 PCR 法在急性呼吸道传染病病原筛查中的应用[J].医药卫生：文摘版：00246-00246.

[2]王建华，赵祥平，董志珍，等.尼帕病毒与猪流感病毒双重荧光定量RT-PCR方法的建立[J].动物医学进展，2016，37（1）：11-16.

[3]郑小龙，王群，邓明俊，等.西方马脑炎病毒TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].动物医学进展，2016，37（1）：6-10.

[4]姚秀林.实时荧光RT-PCR与细胞培养法在流感病毒检测中的应用效果观察[J].中国医药指南，2016（4）：47-48.

[5]隋竑弢，王大燕，舒跃龙.呼吸道病毒多病原检测技术研究进展[J].病毒学报，2013（02）.

[6]方巧云，琚雄飞，曾健君.荧光定量PCR检测急性呼吸道感染患者常见呼吸道病毒的研究[C] 广东省预防医学会优秀论文集.2014.

编辑/安桦