PAs/PAI—1在膜性肾病肾组织中的动态表达及意义

梁静+张渊+孟祥龙+赵玉容+王莉

摘要：目的 建立膜性肾病（MN）大鼠模型，观察PAs/PAI-1在不同时间点肾组织中的动态表达规律，探讨PAs/PAI-1在MN发生过程中的意义。方法 将30只SD雄性大鼠随机分为正常组和模型组，正常组不给予任何处理，模型组按改良Border法[1]，尾静脉注射16 mg/kg C-BSA复制MN大鼠模型，于正式免疫第1、2、3、4 w取材，取材前收集24 h尿，定量动态检测24 h尿蛋白水平（24hUTP），取大鼠肾组织进行光镜、电镜及免疫荧光鉴定成模情况，免疫组化方法动态检测肾组织中t-PA、u-PA、PAI-1的表达。结果 ①模型组大鼠肾脏病理损害随时间延长逐渐加重。②模型组第2 w起24 h尿蛋白水平显著高于正常组（P<0.05）。③模型组肾组织中t-PA、u-PA表达随时间延长呈下降趋势，PAI-1表达随时间延长呈上升趋势；t-PA表达较正常组降低，PAI-1表达较正常组升高，u-PA第1 w末出现短暂升高，以后较正常组降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 肾组织PAs/PAI-1表达失衡是导致MN病理损害、加重蛋白尿发生发展的重要因素。

关键词：阳离子化牛血清白蛋白（c-BSA）；膜性肾病（MN）；组织型纤溶酶原激活物（t-PA）；尿激酶型纤溶酶原激活物（u-PA）；纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）

Abstract：Objective To establish a membranous nephropathy（MN） rat model，dynamic observation of PAs/PAI-1 in the renal tissue at different time points in the expression pattern of PAs/PAI-1，in the production of MN.Methods 30 male SD rats were randomly divided into normal group and model group，the normal group was not given any treatment，model group according to the modified Border method[1]，tail vein injection of 16 mg/kg C-BSA replication model of MN rats，1，2，3，4 w in the official immunity，were collected before 24 h urine，24 h urinary protein quantitative dynamic detection level（24hUTP），renal tissue of rats were studied by light microscopy，electron microscopy and immunofluorescence identification model.T-PA，the kidney tissue was detected with immunohistochemical method in dynamic u-PA，the expression of PAI-1.Results ①The renal pathological damage of rats in model group were aggravated with time.②The model second w 24 h urinary protein level was significantly higher than the normal group （P<0.05）.③The renal tissue of t-PA model group，u The expression of-PA decreased with time，the expression of PAI-1 increased with time； the expression of t-PA decreased compared with the normal group，the expression of PAI-1 increased compared with normal group，u-PA first w appeared at the end of a transient increase，then decreased compared with the normal group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion The expression of PAs/PAI-1 is the result of imbalance the pathological damage of MN，the important factor to worsen the occurrence and development of proteinuria.

Key words：Cationic bovine serum albumin（c-BSA）；Membranous nephropathy（MN）；Tissue type plasminogen activator（t-PA）；Urokinase type plasminogen activator （u-PA）；Plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1）

1 資料与方法

1.1实验材料 牛血清白蛋白（购自国药集团化学试剂成都有限公司）；羊毛脂、液体石蜡、碳化二亚胺（购自厦门星隆达化学试剂公司）；PASM染色试剂盒、Masson染色试剂盒、t-PA、u-PA、PAI-1免疫组化试剂盒（购自福州迈新生物试剂有限公司）；兔抗大鼠IgG多克隆抗体及异硫氰酸荧光素标记羊抗兔荧光抗体（北京博奥森生物技术有限公司提供）。

1.2模型制备与分组 成年健康雄性SD大鼠30只，适应性喂养7 d后检测24 h UTP，均<5 mg。随机分为正常组（10只）和模型组（20只）两组。参照改良Border方法，用c-BSA制作大鼠膜性肾病模型，将牛血清白蛋白经碳化二亚胺处理后制成阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA），模型组大鼠每只取C-BSA 1 mg溶解于0.5 ml生理盐水中与等量不完全弗氏佐剂（自备）充分乳化，在大鼠颈背部皮下多点注射作预免疫。预免疫1 w后正式免疫，每只造模大鼠隔日尾静脉注射C-BSA（16 mg/kg），连续4 w，正常对照组大鼠隔日尾静脉注射等体积NS，均连续4 w。

1.3实验方法及检测指标

1.3.1模型鉴定 每组于正式免疫第1、2、3、4 w将大鼠处死取材，取材前收集24 h尿，记录尿量，检测24 h尿蛋白水平[2]（24h UTP），取材观察肾脏大小及颜色；同时取相应肾组织进行光镜、电镜及免疫荧光检测，观察肾组织病理改变情况。

1.3.2检测指标及方法 ①免疫荧光：采用间接免疫荧光法检测肾组织IgG表达；②免疫组化：参照说明书，采用SP法，检测肾组织t-PA、u-PA、PAI-1的表达，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，以肾实质细胞胞浆内棕褐色颗粒为阳性，在高倍视野下随机选取面积相似的10个肾小球，应用计算机病理图像处理系统对选取的肾小球内u-PA、t-PA、PAI-1免疫组化阳性信号进行图像分析，计算阳性面积平均值，结果以阳性面积×阳性强度表示[3-4]。③GBM厚度的检测：透射电镜下观察肾小球超微结构，GBM厚度以5条以上的基底膜厚度的平均值表示，采用立体计量法测量GBM厚度[5]。

1.4统计学方法 全部数据采用SPSS17.0 for windows软件包统计分析，结果用（x±s）表示，两组间样本均数比较采用t检验，各时间点比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1一般情况 造模后模型组全部大鼠逐渐出现消瘦、懒动、纳差，毛发脱落，抓持反抗能力明显减弱，部分大鼠出现腹水，阴囊水肿。肾组织较正常肾脏增大，包膜紧张，色稍白，双肾呈“大白肾”外观。

2.2动物模型检测结果 模型组：24 h尿蛋白逐渐增多，第2 w起各时间点较正常组差异显著（P<0.05），见表1；第2 w起随试验时间延长，肾小球毛细血管壁荧光强度逐渐增强；光镜下可见肾小球肿大，球囊腔狭窄，肾小球毛细血管壁弥漫性增厚，GBM外侧“钉突”形成，上皮下大量颗粒状红染沉积物，肾小管管腔狭窄，上皮肿胀；电镜下可见GBM弥漫增厚，足突变平、部分融合，上皮下可见分布不均的颗粒状电子致密沉积物。正常组无上述改变，见图1。

2.3肾组织t-PA、u-PA、PAI-1的检测结果 t-PA主要表达在血管内皮细胞、肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞胞浆；u-PA主要表达在肾小管上皮细胞胞浆；PAI-1主要表达在血管平滑肌细胞、肾小管上皮细胞胞浆，而肾小球系膜细胞及肾间质表达极少。模型组自实验第2 w起各时间点t-PA表达较正常组减少（P<0.05），并呈下降趋势；PAI-1表达较正常组增多（P<0.05），呈上升趋势；u-PA于第1 w末出现短暂升高，以后呈下降趋势，各时间点表达较正常组差异明显（P<0.05），见表2，以第4w为例，见图2。

2.4肾组织PAs/PAI-1的结果 正常组：t-PA/PAI-1比值维持在一个较高水平，PAs/PAI-1比值恒定，各时间点比较无差异。模型组：PAs/PAI-1比值随时间延长呈逐渐下降趋势，t-PA/ PAI-1比值第2 w起较正常组差异明显，u-PA/PAI-1比值各时间点较正常组差异明显，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

2.5肾组织GBM厚度检测 模型组：各时间点GBM较正常组显著增加（P<0.01）；随实验时间的延长，GBM呈逐渐增厚趋势，各时间点差异明显，具有统计学意义（P<0.05），见表4。

3 讨论

MN是引起成人原发性肾病综合征的重要原因，其病理特点为肾小球上皮下免疫复合物的沉积伴基底膜弥漫性增厚[6]，临床主要表现为大量蛋白尿及血液高凝状态。MN的发病机制十分复杂，目前对MN发病机制的研究主要以大鼠MN模型为基础，认为是由于循环抗体与大鼠足突细胞足突表面的megalin以及受体相关蛋白RAP结合后，形成上皮下原位免疫复合物，继而激活补体，形成C5b-9膜攻击复合物（MAC），在局部T细胞及细胞因子等的作用下，致使足细胞的损伤、凋亡及脱落以及肾小球滤过膜电荷屏障受损，从而形成大量蛋白尿[7]。

MN的基本病变是肾小球ECM合成与降解失衡所导致的肾小球基底膜ECM的积聚[8]。近年研究证实，肾小球ECM合成与降解的平衡，是决定肾小球ECM积聚和GS的重要环节[9]。体内有多种因子及酶能调节ECM合成及降解，其中纤溶系统在维持血液凝血及纤溶平衡中起重要作用。凝血纤溶系统由PA、纤溶酶原及纤溶酶组成，PAI-1为tPA的快速抑制剂，对维持纤维蛋白溶解系统的稳定性起着决定性作用[10]。国内研究认为MN患者，其机体内的纤溶酶原激活物（PAI）浓度是正常人的6倍，同时纤溶系统活性非常低[11-12]。国外研究证实：在MN患者其肾小球PAI-1 mRNA与t-PA mRNA比率是其他肾小球肾炎患者的六倍之多[13]，本实验同样观察到模型组随实验时间延长GBM逐渐增厚，肾组织损害逐渐加重，蛋白尿逐渐增多，肾脏t-PA表达较正常组减少，PAI-1表达较正常组增多，差异均有统计学意义（P<0.05），且随试验实验延长，t-PA呈下降趋势，PAI-1呈上升趋势，u-PA于第1 w末出现短暂升高，以后呈下降趋势，再次证实PAs/PAI-1参与了GBM增厚及尿蛋白产生和发展，局部PAI-1表达增多、PAs表达减少导致的肾组织ECM合成降解失衡，是MN發生发展的重要环节。

正常生理状态下，肾组织内凝血纤溶处于平衡状态，当平衡被打破，肾小球ECM的过度沉积则会促进肾小球硬化。本实验观察到正常组t-PA/PAI-1比值维持在一个较高水平且恒定，而模型组PAs/PAI-1比值随时间延长呈逐渐下降趋势，同样说明正常情况下，PAs/PAI-1平衡稳定，肾组织ECM合成降解平衡稳定，MN时肾脏局部PAs/PAI-1紊乱，肾小球硬化发生。

综上所述，在MN的发病过程中，PAs/PAI-1的表达参与了ECM 堆积致GBM增厚的过程、同样也参与了蛋白尿的产生发展过程。如何上调肾组织PAs、下调PAI-1的表达将成为人类攻克MN的又一治疗靶点，同时PAI-1抑制剂的开发及应用将成为防止MN病变进一步发展的又一热点。在今后的研究中，如何维持PAs/PAI-1平衡稳定，并找到阻断PAI-1表达的因素，对于抑制肾纤维化的发展，具有极重要的意义。

参考文献：

[1]曹灵，孙兴旺，马跃荣，等.MMP-2、TIMP-1在小鼠膜性肾病肾脏中的表达及意义[J].中国现代医学杂志，2005，15（16）：2421-2425.

[2]梁静，张渊，赵玉容，等.阳离子化牛血清白蛋白诱导膜性肾病模型大鼠足细胞相关蛋白的表达[J].中国组织工程研究，2016，20（40）：6028-6033.

[3]赵黎，朱萌华，金娟，等.肾活检冰冻切片不同储存条件对免疫荧光结果的影响[J].中国病理生理杂志，2016，32（7）：1342-1344.

[4]何日明，门凌，易无庸，等.黄芩素对糖尿病肾病大鼠肾组织p38MAPK表达的影响[J].广东医学，2016，37（20）：3006-3009.

[5]丁鹤林，黎锋，徐明彤，等.抑制核因子-κB对糖尿病肾病的作用[J].中华内科杂志，2002，41（9）：605-609.

[6]陈文军，袁国栋，檀金川.红花黄色素注射液对膜性肾病大鼠的肾保护作用及对基质金属蛋白酶抑制物-1、基质金属蛋白酶-9表达的影响[J].中药药理与临床，2016（3）：148-152.

[7]Mundel P，Shankland S J.Podocyte biology and response to injury[J]. Journal of the American Society of Nephrology Jasn，2003，13（12）：3005-3015.

[8]Ohashi T，Uchida K，Yumura W.[Membranous glomerulonephritis （membranous nephropathy）：Pathogenesis，pathophysiology，and therapy][J].Nippon Rinsho Japanese Journal of Clinical Medicine，2006，64 suppl 2（64 Suppl 2）：417-421.

[9]Ma L J，Fogo A B.Modulation of glomerulosclerosis[J].Seminars in Immunopathology，2007，29（4）：385-395.

[10]韩建武，王学群，李强.胰岛素抵抗、PAI-1与糖尿病肾病的相关性研究[J].齐齐哈尔医学院学报，2013，34（13）：1873-1875.

[11]陆美金.肾病综合征凝血机制的研究现状及其进展[J].中国实用医药，2014，34（9）：244-245.

[12]刘德奎.肾病综合征患者常用凝血-纤溶项目的观察[J].中国医药指南，2009，7（11）：146-149.

[13]Hamano K，Iwano M，Akai Y，et al.Expression of glomerular plasminogen activator inhibitor type 1 in glomerulonephritis[J]. American Journal of Kidney Diseases the Official Journal of the National Kidney Foundation，2002，39（4）：695-705.

編辑/杨倩