基于药效学和指标成分优选鼻鼽颗粒醇沉工艺

2017-04-18张艳军刘莉莉吴云胡军华常秀娟萧

中国中药杂志 2016年24期

张艳军+刘莉莉+吴云+胡军华+常秀娟+萧伟+晁恩祥

[摘要] 通过考察对血清组胺，IgE，IL-4，IFN及TNF-α的影響，评价鼻鼽颗粒醇沉工艺的合理性。以咖啡酸和迷迭香酸的含量为综合指标，采用Plackett-Burman设计筛选影响鼻鼽颗粒水提组醇沉工艺的显著性影响因素；在此基础上，通过Box-Behenken设计对显著性因素进一步优化，确定最佳醇沉工艺。确定鼻鼽颗粒水提组的最佳醇沉工艺条件为：浓缩液相对密度1.15（65 ℃）、醇浓度70%、静止时间12 h。药效学评价结合Plackett-Burman和Box-Behnken设计实验优化确定的醇沉工艺稳定可行，预测性好，为鼻鼽颗粒的产业化生产提供了可靠依据。

[关键词] 鼻鼽颗粒；药效学；Plackett-Burman设计；Box-Behnken设计；醇沉工艺

[Abstract] To evaluate the rationality of alcohol precipitation technology of Biqiu granule by investigating its effect on serum histamine，IgE，IL-4，IFN and TNF-α. The contents of cafferic acid and rosmarinic acid were used as the evaluation indexes，and some factors affecting index were firstly evaluated by Plackett-Burman design；then alcohol precipitation technology was further optimized by Box-Behnken design to determine the optimal alcohol precipitation conditions. The best alcohol precipitation conditions were as follows： the relative density of herb liquor was 1.15 （65 ℃）；the concentration of alcohol was 70%，and standing time was 12 hours. Optimal alcohol precipitation technology of Biqiu granules determined by pharmacodynamic screening，Plackett-Burman and Box-Behnken design tests，was stable and feasible with good predictability，providing reliable basis for the industrialization production of Biqiu granules.

[Key words] Biuqiu granules；pharmacodynamics；Plackett-Burman design；Box-Behnken design；alcohol precipitation process

doi：10.4268/cjcmm20162418

鼻鼽颗粒是由国医大师晁恩祥教授集多年临床经验精心研制的药物，由辛夷、紫苏叶、荆芥、苍耳子、白芷等9味中药材组成，具有疏散风邪，通利鼻窍，疏导肺气，舒缓鼻窍等功效，用于治疗某些致敏因素引起的过敏性鼻炎（常见症状如鼻塞、鼻痒、喷嚏、流清涕等）。中药醇沉处理是制剂过程中常用的纯化方法，具有工艺成熟、过程明确、对设备要求不高等优点，而且可以减少服用剂量、取得良好的成型性[1-2]。本文采用药效学指标对醇沉工艺的合理性进行了评价，以咖啡酸和迷迭香酸含量的综合评分为指标，通过Placket-burman设计[3]对影响鼻鼽颗粒水提醇沉工艺的几个因素进行了筛选，并进一步利用Box-Behnken[4-5]对筛选出的3个主要因素浓缩液相对密度、醇浓度、静止时间进行二次多项式拟合[6-7]，建立了相关预测模型，根据回归模型确定最优工艺参数，为鼻鼽颗粒的生产工艺规范和后续的研究奠定了基础，为中药醇沉工艺的合理性提供实验依据。

1 材料

D2015W 型电动搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）；Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Sartorious BP211电子天平（美国赛多利斯公司）；密度计（北京华科电子仪器开发中心）。

鼻鼽颗粒醇沉前浓缩液（江苏康缘药业股份有限公司，批号20141003）；工艺一（江苏康缘药业股份有限公司，醇沉样品，批号20141201）；工艺二（江苏康缘药业股份有限公司，未醇沉样品，批号20141202）；迷迭香酸对照品，购自中国食品药品检定研究院（批号111871-201102，供含量测定用）；咖啡酸对照品，购自中国食品药品检定研究院（批号110885-200102，供含量测定用）；卵白蛋白OVA，购自sigma（货号A5503）；氢氧化铝Al（OH）₃，购自sigma（货号239186）；鼻炎康片（购自佛山德众药业有限公司，批号12170）；IgE免疫放射分析测定盒，购自北京华英生物技术研究所（批号20141101）；IL-4，TNF-α，IFN放免试剂盒，购自北京华英生物技术研究所（批号20141120）；95%乙醇；药用规格提取工艺用水为纯化水；液相用乙腈为色谱纯；水为重蒸水；其他试剂均为市售分析纯。

SD大鼠，雄性，体重180～220 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号SCXK（沪）2013-0016，SPF级。动物饲养于标准条件下，12 h明暗交替，（22±2）℃，自由摄食饮水。动物在上述环境中适应性饲养1周后开始实验。

2 方法与结果

2.1 样品制备

取鼻鼽颗粒醇沉前液100 g于洁净烧杯中，在搅拌下向药液中匀速加入95%乙醇，乙醇加完后将烧杯封口，室温下静置一定时间，取上清液，即得鼻鼽颗粒醇沉液。

2.2 咖啡酸和迷迭香酸含量测定

2.2.1 色谱条件

Agilent C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.1%磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱（0～50 min，91%～34% A），检测波长327 nm，流速1.0 mL·min^-1，进样体积10 μL，柱温为30 ℃。理论板数按迷迭香酸峰计算均应不低于5 000。对照品与样品色谱图见图1。

2.2.2 对照品溶液的制备

取咖啡酸、迷迭香酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释成每1 mL中含咖啡酸、迷迭香酸分别为4，15 μg的溶液，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备

称取适量醇沉上清液，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 线性关系考察

称取咖啡酸、迷迭香酸对照品适量，加甲醇溶解并定容，摇匀，得浓度分别为22.12，116.92 mg·L^-1的混合对照品储备液，分别精密吸取混合对照品储备液适量，以甲醇倍倍稀释，摇匀，即得。分别进样10 μL，按2.4.1色谱条件进行分析，以进样浓度的对数为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。

2.2.5 精密度试验

分别精密吸取咖啡酸、迷迭香酸的对照品溶液10 μL，按2.4.1色谱条件，进样，测定，连续6次，测得咖啡酸和迷迭香酸的峰面积的RSD为0.60%，0.90%，结果表明，精密度良好。

2.2.6 稳定性试验

精密吸取2.1.3项供试品溶液，按2.2.1项色谱条件，分别于制备后0，2，6，4，8，10，12，24 h分别进样测定，以咖啡酸和迷迭香酸的峰面积计算，结果RSD为0.50%，1.0%，结果表明供试品溶液放置24 h稳定。

2.3 药效筛选

2.3.1 方法

2.3.1.1 大鼠过敏性鼻炎模型建立采用目前国内常用的“卵蛋白注射及其鼻粘膜刺激法”，具体方法：选清洁级SD大鼠，以卵白蛋白（OAV）10 mg，Al（OH）₃30 mg及生理鹽水l mL混合后腹腔注射，隔日1次，连续7次，进行初次免疫；第15天进行加强免疫，每侧鼻孔给予4% OVA 20 μg（50 μL）滴鼻，隔日1次，连续7次。正常组给与等量生理盐水[8]。

过敏性鼻炎动物模型成功标准：于末次滴鼻致敏后观察30 min大鼠搔鼻、喷嚏、鼻溢等行为，以上各项指标均采用叠加量化记分法，总分>5分表示造模成功，之后继续隔天滴鼻维持直至治疗实验结束。

记分方法：①鼻痒：抓挠3 次为1 分，3～10 次2 分，抓挠不止3 分；②喷嚏：1～3个为1分，3～5 个2 分，连续喷嚏3 分；③清涕：流至鼻孔为1分，超出前鼻孔为2分，涕流满面为3分。

2.3.1.2 分组及给药 60只大鼠随机分成5组，每组12只。分别空白对照组，模型对照组，鼻炎康对照组0.4 g·kg^-1，工艺一、工艺二 2.0 g·kg^-1。除空白组外，其他各组动物于致敏第15日开始给药，每日1次，连续14 d[8]。

2.3.2 指标检测

2.3.2.1 过敏性鼻炎SD大鼠行为学观察在OVA 滴鼻30 min 内观察鼻炎症状，记录挠鼻、喷嚏次数及清涕出现的轻重程度，每日观察1次。用积分迭加法评分（挠鼻：抓挠3次为1分，3～10次2分，抓挠不止3分；喷嚏：1～3个为1分，3～5个2分，连续喷嚏3分；清涕：流到鼻前孔1分，超过鼻前孔2分，涕流满面3分）。

2.3.2.2 血清组胺，IgE，IL-4，IFN及TNF-α检测末次给药30 min后，水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，分离血清，-70 ℃保存，根据试剂盒说明方法进行IgE，IL-4及TNF-α测定。

2.3.2.3 统计学处理所有数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，统计软件SPSS 17.0。

2.3.3 结果

2.3.3.1 SD大鼠行为学改变情况模型大鼠出现典型的过敏性鼻炎的症状（频繁的抓鼻、打喷嚏和流鼻涕等），经过阳性对照组、工艺一及工艺二连续给药后的评分结果见表1。与模型组比较，阳性对照组、工艺一及工艺二均可以降低抓鼻、打喷嚏和流鼻涕的频率，其中工艺一差异具有非常显著的意义（P<0.001）。与阳性对照组及工艺二比较，工艺一的评分差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.3.3.2 对血清组胺，IgE，IL-4，IFN及TNF-α的影响与空白组比较，模型组血清IgE，组胺，IFN及TNF-α处于较高水平，差异具有显著意义（P<0.01），见表2。与模型组比较，鼻鼽颗粒不同工艺血清细胞因子水平均有下降趋势，工艺一可降低IgE和IFN，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），工艺二可降低TNF-α，差异有统计学意义（P<0.05）。综合评价，鼻鼽颗粒治疗过敏性鼻炎降低免疫因子水平方面疗效明确，相对于醇沉前样品（工艺二），醇沉样品（工艺一）可显著降低血清组胺，IgE，IFN及TNF-α水平，效果较好。

2.4 实验设计

2.4.1 Plackett-Burman试验设计

Plackett-Burman 试验对每个因素取3个水平（-1，1），在预实验的基础上，选取影响较大的6个因素：搅拌速度（A，400，600 r·min^-1）、加醇速度（B，3.0，5.0 mL·s^-1）、静置温度（C，20，40 ℃）、静置时间（D，10，14 h）、浓缩液相对密度（E，1.05，

1.20）、醇浓度（F，60%，80%），进行试验。Plackett-Burman 设计自动生成12次试验，每组试验重复3次以上，以3次试验咖啡酸和迷迭香酸含量的综合评分（综合评分=咖啡酸/最大含量×50+迷迭香酸/最大含量×50）为考察指标，试验设计及结果见表3，各因素对考察指标影响的次序见图2。

由帕拉图 2 可知，因素静置时间、浓缩液相对密度、醇浓度影响比较显著，可作为下一步试验优化的因素。因素A，B，C效应不显著，对试验结果影响较弱，在下一步研究中分别设定搅拌速度500 r·min^-1、加醇速度4.0 mL·s^-1、静置温度30 ℃。

2.4.2 Box-Behnken 试验设计

根据Plackett-Burman筛序结果，以咖啡酸和迷迭香酸含量的综合评分为考察指标，选取浓缩液相对密度（A）、醇浓度（B）、静置时间（C）3个因素为自变量，每个自变量的低、中、高实验水平分别以-1，0，1进行编码。每个实验重复3次，取平均值，Box-Behnken试验设计及结果见表4。

2.4.3 Box-Behnken 试验结果分析

利用Design-Expert8.0软件对表4中数据进行二次回归拟合，得出回归拟合方程：R综合评分=94.46+4.05A-2.05B+1.66C-1.85AB-5.87AC-1.14BC-13.24A²-6.62B²-2.05C²，标准差1.49，R²=0.990 1。对模型进行方差分析，结果见表5。表明模型P<0.001，响应面模型达到显著水平，影响醇沉工艺因素的主次顺序为A>B>C，其中因素A（浓缩液相对密度）影响比较显著（P<0.001），交互作用中AC的影响比较显著（P<0.001），失拟项（P>0.05）不显著，表明二次方程预测值与实际值吻合度较高。各方程对应的三维响应面图、等高线见图3。

2.4.4 验证试验

应用Design-Expert 8.0.6软件对影响鼻鼽颗粒水提组醇沉工艺的显著性影响因素综合分析，得到醇沉的最佳工艺：浓缩液相对密度1.13、醇浓度68.04%、静置时间12.65 h、综合评分为95.50。考虑到生产实际情况，故将工藝参数设定为：浓缩液相对密度1.15、醇浓度70%、静置时间12 h，以该工艺参数进行3次验证试验，取其平均值，综合评分为93.85，基本与模型预测值一致，说明模型优化结果可信，确定的最优工艺适合生产要求。

3 讨论

紫苏叶、荆芥分别为方中的君药和臣药，在临床上应用比较广泛，可用于治疗呼吸道疾病如变应性喉炎、鼻炎、呼吸道过敏等[9-12]，其中都含有酚酸类成分咖啡酸、迷迭香酸[13]。迷迭香酸具有抗过敏、抗氧化和免疫抑制等多种活性[12，14]，ToshiakiMakino等证明迷迭香酸具有抗过敏作用，并且在体内有一定的治疗作用[15]。李林等研究发现迷迭香酸对大鼠抗Thyl.1系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）具有治疗作用及能下调肾组织中转化生长因子β1（TGF-β1）的表达，从而起到治疗炎症的作用[15-16]。咖啡酸亦具有抗炎、抗菌、抗病毒、升高白细胞及血小板等多种药理作用，杨九凌等[17]、王琦等[18]通过检索国内外文献，对咖啡酸的抗氧化、抗炎、镇痛、免疫调节等多种药理作用进行了报道。故本文选择咖啡酸和迷迭香酸作为工艺优选的评价指标。此外，苍耳子中的绿原酸在抗氧化、抑菌、抗炎、抗病毒等有一定的疗效[19-20]。

Plackett-Burman设计是一种2水平的试验设计方法，它试图用最少试验次数筛选并确定对结果影响比较显著的因素，避免在后期的优化试验中由于部分因子不显著而浪费试验资源，已经被广泛应用于化学、质量控制和食品科学等领域[5]。Box-Behnken响应面分析法克服了目前正交实验只能给出最佳因素水平组合的缺点，不仅仅可以通过相关数据进行拟合，筛选出整体因素中的最佳工艺组合和响应值，而且能够在因素和响应值之间建立模型，对实验的预测性较好，信息量大，精度度高，在未来中药领域的研究中会越来越广泛[6-7]。

由于中药复方成分复杂，在中间体精制过程中，采用切实可行的综合评价方法，可以更好的发挥醇沉工艺的实用性和科学性[21]。本文先通过药效评价法确定醇沉工艺的合理性，在不影响药效的前提下，利用Placket-Burman设计和Box-Behnken设计相结合，以咖啡酸和迷迭香酸含量的综合评分为指标，对鼻鼽颗粒醇沉工艺进行了优化，并建立了相关数学模型，具有较好的预测性。验证试验表明，该工艺稳定可行，醇沉精制后，除去了药材中的杂质，减少了给药剂量，提高了药物的稳定性，为后续的鼻鼽颗粒制剂研究奠定了基础，同时为中药浸膏的醇沉工艺研究提供了一定的理论指导。

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