生物法合成谷胱甘肽及其分离纯化条件研究进展

*何 轶

(成都石室中学北湖校区 四川 610000)

生物法合成谷胱甘肽及其分离纯化条件研究进展

*何 轶

(成都石室中学北湖校区 四川 610000)

谷胱甘肽是细胞内重要活性物质,在维持生物体内稳态方面起着重要作用.本文综述了生物合成法生产谷胱甘肽的条件优化策略和分离纯化的研究进展,简单介绍了谷胱甘肽生物合成和分离转化的发展前景.

谷胱甘肽;合成;分离纯化

1.前言

谷胱甘肽的全称是γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸,(γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine,简称GSH).其相对分子量为307.33,等电点为5.93.它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键形成,分子中有一特殊的γ-肽键,即由谷氨酸的γ-COOH与半胱氨酸的α-NH2缩合成的肽键,它不同于蛋白质分子中的普通肽键.GSH为白色晶体,易溶于水、低浓度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺.谷胱甘肽是广泛存在于动植物和微生物中,是生物体内最重要的非蛋白巯基化合物之一,是一种具有重要生理功能的天然活性肽.其在体内以两种形态存在,还原型谷胱甘肽(γ-GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG),还原型谷胱甘肽的基本单元是L-谷氨酸、L-半胱氨酸及甘氨酸.两分子还原性谷胱甘肽的巯基(-SH)经氧化脱氢得到氧化型谷胱甘肽.还原型谷胱甘肽在生物体中存在大量并起主要作用.其较好的抗氧化,清除自由基作用,可以用于药物.研究表明,发挥抗氧化等作用的活性位点是谷胱甘肽的巯基(-SH).GSH还在蛋白质和DNA合成、物质运输、酶活性、新陈代谢及细胞保护等生物学功能中起着直接或间接的作用.许多酶反应的辅基也是GSH,主要参与生物体三羧酸循环及糖代谢.具有良好的解重金属毒性、预防糖尿病、消除疲劳或抗癌作用.GSH可抑制肉食类、鱼类和海鲜类食品的核酸分解,延长保鲜期以及提高奶酪质量,防止酪蛋白褐变,作为生物和食品活性添加剂及抗氧化剂用于食品及化妆品领域.

目前对于还原性谷胱甘肽的制备方法的研究,主要集中于溶剂提取法、酶合成法、液相合成法和生物发酵法.溶剂提取法生产工艺比较落后,生产规模小且产量低,产品质量不高.液相合成法反应步骤多、反应时间长、操作复杂、需光学拆分且产品纯度不高,环境污染严重.缺点都较明显,使用较少.酶合成法操作较复杂且需要底物氨基酸和昂贵的ATP,成本高.目前工业生产以发酵法为主,但因其所得的目标产物含量不高、提取困难、成本造价高、产率不稳定,生产周期长等原因,应用也受到限制.成本低,操作简便,产率较高,纯化效果好的合成方法有待进一步发展.

2.谷胱甘肽的生物合成

郑丽雪等人开展以葡萄糖和半胱氨酸与葡萄糖协同作用两种方式,研究了酵母对分批发酵谷胱甘肽的影响,发现GSH分批发酵48h后生物量GSH产量降低,原因是菌体开始自溶,发酵液中菌体浓度下降.同时GSH易被氧化,所以其浓度也随之小幅下降,所以在高密度发酵中,加入适量葡萄糖对GSH积累很重要,发酵直至24h,GSH产量直线上升,总量提高37%,但L-半胱氨酸添加有待优化,因此在补料分批发酵中采用恒定PH分批发酵来提高GSH产量有较大发展空间.

丁橘等开展了在少量可供应ATP的南极硅藻GJ01细胞存在下,对其游离谷胱甘肽合成酶合成谷胱甘肽的条件进行优化,主要对温度、pH、浓度、前体氨基酸和镁离子浓度对其合成能力进行探究.镁离子对谷胱甘肽合成酶有激活作用,对ATP产生也有影响,所以提供少量镁离子有利于谷胱甘肽的产生.而南极硅藻GJ01的谷胱甘肽的合成酶属于低温酶,在温度较低情况下也能合成生命所需的谷胱甘肽,这将大大减少工业生产中能耗,这对于未来酶法生产谷胱甘肽具有指导意义.

张亮等对酶法合成谷胱甘肽进行了优化并通过DTNB法检测.主要对温度、pH、反应时间和ATP浓度进行了讨论.从实验可以看出反应温度35℃,pH8.0反应浓度12.5mmol/L,反应时间120min能达到最优反应结果,GSH的产量达到最大值为1.78g/L.该探究直观反映出容变量对GSH产量影响的关系,并且加入了空白对照,提高了实验严谨性.但美中不足的是缺乏对变量影响结果的原因的探究.

杨莉等人通过单因素及正交试验时酿酒酵母摇瓶发酵产谷胱甘的培养条件进行优化,主要讨论了葡萄糖浓度,接种量、装液量、发酵时浓度、pH对谷胱谷肽合成影响.得出的最佳条件是:初糖浓度20g/L,接种量8%,发酵时间54h,装液量50mL/250mL.该实验展示了具体数据并用文字展现了变化趋势并且对优化前后结果进行了比较.

3.谷胱甘肽的分离纯化

离子交换树脂工业近几年在我国迅速发展,树脂具有可多次循环利用,成本低、分离速度快,能工业化的优点,所以对于树脂材料分离GSH的研究成为热点.大孔吸附树脂是上世纪后半叶出现的新型高聚物吸附剂,利用不同孔径、极性的大孔吸附树脂,在吸附特性和分子筛作用下,利用不同的树脂能达到分离纯化不同化合物的目的.

张玉然等人通过对D021、201*7、D354、D840、D001、001*7六种树脂对分离传化谷胱甘肽的对比,确认D840树脂吸附容量最高,在pH=4.29时吸附量最大.因为pH=4.29时,GSH整体带负电荷,更强竞争性,吸附D48树脂功能基因末端的氨基和亚氨基在pH=2.02时样液中存在大量的氢离子,影响GSH的吸附,此外使用0.3mL/盐酸在1mL/min的流速下洗脱效果最好,得到洗脱液回收率72.08%,GSH纯度约50.5%.此种树脂交换容量大,树脂使用率高,成本低,但树脂上样液量较大.最适浓度需进一步探究.分离高纯度GSH产品可以在此基础上进行.

朱义福等人利用大孔吸附树脂对GSH发酵抽提液分离纯化进行了研究.发现吸附150min后,吸附达到饱和,处于吸附平衡状态.当GSH浓料液pH=3.0时,吸附容量与吸附率均高于其他pH下大孔吸附树脂对GSH的吸附.在研究盐酸、氯化钠、磷酸平衡缓冲液实验效果中,发现磷酸最佳,选用0.2mol/L并以2.00mL/min流速均匀洗脱.最终GSH纯度从58.5%提高到95.3%,并且GSH回收率到达87.15%,效果较好.

赵红玲等以高产菌株发酵提取液为基础对两种阳离子交换树脂(001*7、HZ-011)、2种大孔强酸性阳离子交换树脂(D001,HD-81)、一种大孔弱酸性阳离子交换树脂(D113)进行筛选,并探究了时间pH、GSH浓度对吸附量的影响.可以看出120min能达到吸附平衡.D001吸附容量大,001*7树脂在PH=3时吸附高,可达到3.57mg/g.GSH浓度提高时,001*7树脂的吸附量也增加,GSH浓度gt;150mg/L吸附趋于平衡,达到了饱和吸附.但001*7离子交换树脂动态分离纯化条件优化需进一步探究.

邱雁临等提出了从酵母中分离GSH的新方法,使用适用于分离纯化还原型谷胱甘肽的005*7强酸型阳离子交换树脂,并通过正交试验对渗透法提取GSH与对羟基苯甲酸丙酯法进行了对比试验.渗透法操作后处理更加简便(无需搅拌、絮凝、化学药品也仅需加入盐酸),提取效果好.通过两种提取液上离子交换柱对比,渗透法收率远高于对羟基苯甲酸丙酯法,对于未来研究具有启示意义.虽然005*7型苯酸强酸型阳离子交换树脂分离纯化GSH可行,但其产品纯度有待进一步提高.

王硕等人进行对还原型GSH的发酵与分离添加优化详细讨论了多种变量的影响.具有指导意义的发现在于对树脂法分离提纯GSH进行了优化,此前树脂法特点为条件温和成本低,但产品纯度不高、收率低.本实验选用碳酸氢铵溶液作为大孔树脂D001*7的洗脱液,洗脱流速为1.0mL/min使杂蛋白能与GSH有效分离,此外碳酸氢铵分解产生二氧化碳,氨气和水不会引入新杂质,洗脱能力强,收率高和纯度高为大规模工厂化生产GSH提供了理论基础.

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何轶(2000-),男,成都石室中学北湖校区;研究方向:化学.

Research Progress of Biosynthesis of Glutathione and lts Purification Conditions

He Yi
(North Lake Campus of Shishi Middle School of Chengdu City, Sichuan, 610000)

Glutathione is an important active substance in cells and plays an important role in maintaining the homeostasis of organisms.In this paper, the optimization strategy of glutathione production and the research progress of separation and purification were reviewed, and the development prospect of glutathione biosynthesis and separation and transformation was briefly introduced.

glutathione;synthesis;separation and purification

O

A