烟草及烟草制品中糖的高效液相色谱分析

*侯佰立

(玉溪市质量技术监督综合检测中心 云南 653100)

烟草及烟草制品中糖的高效液相色谱分析

*侯佰立

(玉溪市质量技术监督综合检测中心 云南 653100)

综述了烟草及其制品中糖的高效液相色谱分析的研究现状、色谱条件优化、样品提取与纯化等,为建立高效、准确、灵敏度高的烟草糖检测方法提供技术支撑.

烟草;糖;高效液相色谱

1.引言

烟草含糖量为40%左右,主要为水溶性糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖.在烟叶加工过程中,前3种糖和转化糖(葡萄糖和果糖混合物)常被添加至烟草中.烟草添加剂如果汁、蜂蜜、焦糖也含有较高含量的糖.

糖特别是水溶性糖在烟草制品中可起到加香、使吃味醇和、调整烟气焦油生成量和保润的作用,但糖含量过高反而会对烟草品质产生不利影响,继而损害吸烟者身体健康.因此,测定烟草及其制品中糖含量对提高卷烟品质具有重要意义.本文从色谱条件和样品制备两方面对烟草及其制品中糖的HPLC分析研究进展进行了主观综述.

2.色谱条件

(1)检测器

由于糖在紫外光区无吸收,且在烟草及其制品中含量较高,常选用示差折光检测器(RID).但RID易受温度、流动相组成、流速等波动的影响,不能进行梯度洗脱,一定程度上影响检测灵敏度、分离效能和准确度.为弥补这一不足,如今HPLC-RID仪器已经在流速恒定和光学元件温度控制上有了一定的改进.黄翼飞把RID光学元件温度保持在35℃.

蒸发光散射检测器(ELSD)是一种新型的通用检测器,不要求恒温恒流速、稳定性好、灵敏度高,可进行梯度洗脱,但使用成本较高.漂移管温度和载气流速是ELSD的两个重要参数.随不同的烟草样品和色谱柱,漂移管温度多设置为80℃、85℃、90.7℃和95℃,载气选用空气,流速一般为1.5L/min、2.0L/min、2.1L/min,或选用N2,流速一般为2.0L/min、2.4L/min,可达到最小的噪声信号,色谱图基线平稳.汤建国等建立的超高效液相色谱ELSD法中,漂移管温度55℃、载气N2压力276kPa(40Psi).

(2)色谱柱与柱温

常用色谱柱有三类:专用糖分析柱如Prevail糖柱、Alltech高效糖柱,柱长25cm,柱内径4.6mm,填料颗粒5μm;氨基柱如Acquity UPLC BEH Amide柱(2.1mmX50mm,1.7μm)、Kromasil氨基柱(4.6mmX250mm,5μm)、High-Performance Carbohydrate卡套柱(4.6mmX250mm,4μm);阳离子交换色谱柱,如钙型色谱柱(Waters Sugar Pak1、Metacarb67C),柱长30cm,柱内径6.5mm,及铅型色谱柱(Varian Metacarb Pb PLUS,7.8mmX300mm).黄菲等比较了High-Performance Carbohydrate柱和Varian Metacarb Pb PLUS柱,发现使用后者和水流动相可达到较低的检测限,各糖可实现完全的基线分离,分离性好、色谱峰的保留时间稳定.因为相比氨基柱,此柱在使用过程中柱流失极小,所以检测基线波动极小,灵敏度较高.钙型阳离子交换色谱柱Waters Sugar Pak1,通过体积排阻、配位交换的双重分离机理,可使各低聚糖组分分离.黄翼飞、黄菲等比较了Sugar Pak1 与Metacarb 67C两根钙型阳离子交换色谱柱,发现后者使用简便、分析效果和重现性较好.程勇等采用的Prevail糖柱没有化学降解现象,在室温及梯度洗脱情况下亦很稳定.

(3)流动相、流速、洗脱方式

糖柱、氨基柱流动相多为70%～80%(体积比)乙腈水混合溶液,流速多为1.0mL/min～1.5mL/min,常使用等度洗脱方式,采用ELSD时可采用梯度洗脱方式.黄翼飞使用预混的乙腈水溶液作为流动相,并在使用超过24h后,重新配制或按1%左右的体积比例添加适量的乙腈,色谱基线波动较小,保留时间等参数较稳定.周元清等发现,用乙腈水作流动相效果好于用甲醇水,流动相为70%乙腈水,流速为1.0mL/min,得到色谱峰形较好,各组分实现基线分离、分离性好,分析时间合适,提高了分析灵敏度.汤建国、毛智慧等选择梯度洗脱方式,以水(A相)-0.2%三乙胺/乙腈(B相)体系作为流动相,流速0.15 mL/min,结果满意.

阳离子交换色谱柱常用超纯水为流动相、低流速等度洗脱,水便于随时更换,经济、安全、清洁环保,检测条件恒定,能提高RID的灵敏度及检测重现性.高流速可以缩短分析时间,但会使柱压大大升高,且可能降低目标色谱峰与杂质峰的分离度.黄菲等使用Varian Metacarb Pb PLUS色谱柱,流速为0.4mL/min.Waters Sugar Pak1钙型阳离子交换柱在流动相水中加入少量EDTA钙钠可减少柱材料上的钙离子流失,延长柱的寿命.但黄翼飞、黄菲等发现,分析时间大于1天时,为防止CO2等气体溶入,需要加温使流动相温度维持在70℃以上,随之引起EDTA钙钠浓度变大,使得糖保留时间发生改变,引起基线波动.

3.样品制备

(1)提取

提取溶剂主要有水、NaOH溶液、有机溶剂(如乙醇、甲醇、乙腈)与水的混合溶液.常采用水浴加热和超声/回旋振荡来提高提取效率.

烟草样品中的糖可用70%乙醇超声辅助提取,但由于色素也溶于其中,会降低检测器灵敏度.目前多数研究中采用水作为提取剂,王璐等研究发现,在40℃～50℃下,水超声浸取30min即可使糖完全溶出,且多糖水解率很低,保证结果的准确性,糖提取液最好在当天测定.程勇等研究发现,用55%乙腈水溶液作溶剂,1-鼠李糖等8种糖溶解性均较好,在选定的液相条件下,8种糖的色谱峰的拖尾因子值均在1.03～1.2之间,各峰间分离度值≥1.4,明显优于用水、85%乙腈水溶液作溶剂.

0.01mol/L NaOH溶液也是常用的提取剂,与水相比,二者提取效率相当,但前者有利于防止蔗糖在烟草样品提取液放置时发生水解,确保测试结果的真实性.

(2)纯化

烟草样品中除了糖,还含少量其他成分(如植物碱、酚类、醛酮、蛋白质、油脂、色素、有机酸、无机盐、颗粒物等),为消除干扰,减少这些物质对色谱柱的污染,需要进一步纯化提取液.过去用乙酸铅沉淀单宁、蛋白质,再用饱和草酸钠除去过量的乙酸铅.近年来,固相萃取(SPE)逐渐成为纯化样品的首选方法.毛智慧等比较了ODS-C18、Waters Sep Pak- C18、Oasis MCX和Waters Oasis HLB固相萃取小柱,结果发现Waters Oasis HLB固相萃取小柱效果较好.残余少量的有机酸和无机盐等用SEP-PAK Alumin Cartridges保护柱在线除去.

以上,研究者对测定烟草及其制品中糖的HPLC法进行了线性关系与检出限分析、精密度试验、加标回收率试验等.这些方法的线性范围均比较宽,线性相关系数一般在0.999以上,检出限一般为0.1～1μg/mL级,精密度RSD基本小于5%(n≥5),回收率多数在100%左右,说明这些方法准确度高,重复性较好,适用范围较广,灵敏度较高,有的检出限甚至低至10ng,RSD低至0.44%～0.90%.但有的方法对有的糖回收率稍低、检出限稍高,相关系数也略小,说明方法还需要改进.

[1]魏玉磊.烟草中糖对主流烟气成分的影响研究[J].食品工业,2010,(3):62-64.

[2]黄冀飞.高效液相色谱法测定烟草中的果糖、葡萄糖和蔗糖[J].烟草化学,2010,(1):40-43.

[3]S Cardenas,M Gallego,M Valcarcel.Anal Chim Acta,1999,402:1.

侯佰立(1985-),女,玉溪市质量技术监督综合检测中心;研究方向:食品与化工产品的检验.

HPLC Analysis of Sugar in Tobacco and Tobacco Products

Hou Baili
(Yuxi city quality technical supervision integrated testing center, Yunnan , 653100)

This paper roundups the research status of the high performance liquid chromatography analysis of sugar in tobacco and tobacco products, optimization of chromatographic conditions and sample extraction and purification, providing technical support for establishing a high efficiency, accurate and high sensitivity detection method of tobacco sugar.

tobacco;sugar;high performance liquid chromatography (HPLC)

T

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