高效杀灭松材线虫药物配制*

福建师范大学生命科学学院 蔡文欣 朱碧云 陈晓峰 曹丹 廖艺楠 郭楠楠

高效杀灭松材线虫药物配制*

福建师范大学生命科学学院 蔡文欣 朱碧云 陈晓峰 曹丹 廖艺楠 郭楠楠

为了寻找高效、安全杀线虫药物，本研究通过实验考察茶皂素（TS）、甲维盐等对松材线虫（Bursaphelenchus xyloplilus）的毒性作用，分离、培育松材线虫作为室内实验对象，测定不同浓度TS溶液、甲维盐溶液、TS和甲维盐混合溶液的杀线虫活性。结果表明，TS溶液、甲维盐溶液、TS和甲维盐混合溶液均具有较强的杀线虫活性，10mg/mL TS和1.2mg/L甲维盐混合溶液处理8h能100%杀灭实验松材线虫。

茶皂素 甲维盐 松材线虫病

松材线虫病（又称松树萎蔫病）是一种毁灭性病害，具有发病速度快、难以防治等特点，对我国丰富的松材资源构成严重的威胁。松褐天牛(Monochamus alternatus Hope)是它的主要传媒昆虫，松材线虫通过松褐天牛补充营养的伤口进入木质部，寄生在树脂道中，大量繁殖最终造成松材枯萎死亡。

茶皂素（Tea sponion，TS）是从山茶科植物种子或茶籽饼粕中提取的一种五环三萜类化合物，具有表面活性、生理活性和溶血性等特点，可作为农药制备助剂和增效剂[1]。吴慧平等人的研究表明，茶皂素对松材线虫具有选择性致死活性和环境友好性，可用于制备杀灭松材线虫的植物源农药[2]。来燕学等人的研究表明，甲维盐能快速、高效杀灭松材线虫，1h半致死浓度仅为0.3mg/L，具有良好的应用前景[3]。本研究测定不同浓度茶皂素和甲维盐混合溶液对松材线虫的毒性作用，为开发树干注射剂防治松材线虫病提供了基础。

1 材料与方法

1.1 松材线虫的分离和培养

供试松材从福州市闽侯县采集，采用贝尔曼漏斗法分离松材线虫，在铺满盘多毛菌（Pestalotia sp.）PDA培养基上28℃进行培养和繁殖[4]。

1.2 供试药剂

茶皂素粉（98%茶皂素，西安文竹生物科技有限公司），吐温80（上海生物工程有限公司），1%甲胺基阿维菌素苯甲酸盐（Emamectin benzoate，简称甲维盐），乳油（京博农化科技股份有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 配制实验试剂

（1）TS溶液配制。将含茶皂素98%的茶皂素粉溶解于无菌水中，以0.2%吐温80为助溶剂，配置成0.5、2.5、5、7.5、10mg/ml溶液。

（2）甲维盐溶液配制。将1%甲维盐乳液以无菌水进行稀释，配置成0.3、0.6、0.9、1.2mg/L溶液。

（3）TS和甲维盐混合溶液配制。将含茶皂素98%的茶皂素粉溶解于已配置合适浓度的甲维盐溶液中，以0.2%吐温80为助溶剂，配置成10mg/mL TS和0.3mg/L甲维盐溶液、10mg/mL TS和0.6mg/L甲维盐溶液、10mg/mL TS和0.9mg/L甲维盐溶液、10mg/mL TS和1.2mg/L甲维盐溶液。

1.3.2 实验方法

利用浸渍法测定试剂的离体杀线活性，用尖细吸管将60条供试松材线虫挑入1.5mL离心管，加入200μL各浓度试剂，混合均匀置于28℃恒温箱中静置。分别处理一定时间，2000 r/min离心5min后移去上清液，用无菌水清洗线虫2次，加50μL无菌水复苏4 h，在双目解剖镜下镜检，检测线虫的死亡数，各处理设置3个重复。以0.2%吐温溶液或无菌水为对照，当对照死亡率低于5%时，不作校正计算，杀线虫活性强度分级方法[5]。

校正死亡率=（处理死亡率-对照死亡率）/（1-对照死亡率）×100%

2 结果与分析

2.1 TS溶液杀线虫活力测定与分析

TS溶液作用4h后，线虫开始出现死亡，死亡率随TS溶度上升和作用时间延长而增加，10mg/mL TS溶液、处理36h时达到最高致死率（90.56%）；0.5mg/mL、2.5mg/mL低浓度TS溶液对线虫无活性，5mg/mL TS溶液对线虫为中强活性，7.5mg/mL、10mg/mL TS溶液对线虫为强活性。结果表明，10mg/mL TS溶液对于线虫具有良好的杀灭活性，线虫死亡率和死亡速度明显高于其他浓度，但作用36h后，死亡率未达到100%，说明单一TS溶液杀灭线虫效果不足。

图1 不同浓度TS溶液处理松材线虫的死亡率

2.2 甲维盐溶液杀线虫活力测定与分析

甲维盐溶液对松材线虫具有明显的杀灭特性，在不同浓度和时间下都具有很高的死亡率，能快速、高效地杀灭松材线虫。1.2mg/L甲维盐溶液、处理4h死亡率高达87.22%，处理8h达到最高致死率（93.33%），对松材线虫为强活性。结果表明，1.2mg/L甲维盐溶液能高效、快速杀灭线虫，但作用8h后死亡率未达到100%，说明单一甲维盐溶液杀灭松材线虫的效果仍然有所不足。

图2 不同浓度甲维盐溶液处理松材线虫的死亡率

2.3 TS和甲维盐混合溶液杀线虫活力测定与分析

TS和甲维盐混合溶液具有明显的杀灭活性，在不同浓度下处理8h线虫死亡率均有明显提升，0.9mg/L、1.2mg/L混合溶液处理线虫8h死亡率均达到100%，具有良好的应用前景。TS具有良好的农药增效性，10mg/mL TS和0.3mg/L甲维盐混合溶液处理8h线虫死亡率达92.22%，达到强活性，提升效果显著，线虫死亡率比单一采用TS或甲维盐溶液处理有明显提升。

图3 不同浓度TS和甲维盐混合溶液处理松材线虫死亡率

3 讨论

实验结果表明，TS和甲维盐对松材线虫都具有良好的杀灭活性，但单一试剂杀灭效果仍有不足，TS和甲维盐混合试剂具有更佳的杀灭特性，10mg/mL TS和1.2mg/L甲维盐混合溶液处理8h能100%杀灭实验松材线虫，具有良好的应用前景。松材线虫神经系统发达，可成为高效神经毒剂的靶标，甲维盐能干扰松材线虫的神经生理活性，造成神经膜电位极化，阻断神经传导，导致线虫死亡[6-8]。茶皂素具有良好的农药生物活性和表面活性，可提升农药作用效果、降低农药使用量，可作为一种良好的植物源农药及环保性农药增效剂。我国是油茶产量最高、栽培面积最大的国家，每年可生产大量茶皂素，对于资源利用有积极意义，将带来明显经济效益。

[1]郝卫宁，曾勇，胡美英,等.茶皂素在农药领域的应用研究进展[J].农药，2010，49（2）：90-93.

[2]吴慧平，宛晓春，侯如燕,等.茶皂素杀线虫活性测定分析[J].植物病理学报，2007，37（5）：553-555.

[3]来燕学，池树友，王亚红,等.杀灭松材线虫的高效药物筛选与毒性测定[J].浙江农林大学学报，2011，28（3）：479-485.

[4]方中达.植病研究法[M].北京：中国农业出版社，1998.

[5]王龙平，宛晓春，侯如燕,等.油茶等植物提取物及制剂抑线效果[J].安徽农业大学学报，2013，40（4）：642-648.

[6]张绍生.植物线虫病害的诊断和防治[M].福州：福建科学技术出版社，1991.

[7]闫淑萍，赵健.阿维菌素及其衍生物的合成[J].河北化工，2004(6)：6-9.

[8]耿群美，李兰城，贾晓英.苦参碱、氧化苦参碱对小鼠脑中递质γ-氨基丁酸和甘氨酸含量的影响[J].内蒙古医学院学报，1992，14(1)：8-9，12.

福建师范大学2016年国家（省）级大学生创新训练计划项目（编号：201610394069）。通讯作者：陈晓峰，E-mail：14858095@qq.com。