Ⅰ期非小细胞肺癌淋巴结中ck19、肺特异性蛋白X mRNA表达与微转移及预后的相关性研究

陆薇 梁克诚 吴汉刚 梁新梅 覃灏

Ⅰ期非小细胞肺癌淋巴结中ck19、肺特异性蛋白X mRNA表达与微转移及预后的相关性研究

陆薇 梁克诚 吴汉刚 梁新梅 覃灏

目的 研究Ⅰ期非小细胞肺癌淋巴结中细胞角蛋白19(ck19)、肺特异性蛋白X(LUNX) mRNA表达与转移及预后的相关性。方法 选择68例我院胸外科术后经病理证实为Ⅰ期非小细胞肺癌患者(观察组)和20例确诊为肺炎性假瘤病例(对照组)，将入选病例肿瘤组织、肺门旁(N1)、纵隔淋巴结(N2)蜡块，分别做HE染色和免疫组化检测CK19、LUNX mRNA因子表达。结果 68例Ⅰ期非小细胞肺癌患者肿瘤组织均有CK19、LUNX mRNA表达，肺炎性假瘤病例患者淋巴结未见CK19、LUNX mRNA表达。22例淋巴结可见CK19表达，腺癌17例，鳞癌5例；ⅠA期8例，ⅠB期14例。15例淋巴结可见LUNX mRNA表达，腺癌11例，鳞癌4例；ⅠA期5例，ⅠB期10例。腺癌患者淋巴结CK19、LUNX mRNA表达显著高于鳞癌患者，ⅠB期患者淋巴结CK19、LUNX mRNA表达显著高于ⅠA期患者。鳞癌患者与腺癌患者、ⅠB期与ⅠA期患者的N1淋巴结CK19、LUNX mRNA表达差异不明显，鳞癌患者与腺癌患者、ⅠB期与ⅠA期患者的N2淋巴结CK19、LUNX mRNA表达差异显著(P<0.05)。仅N1淋巴结表达CK19、LUNX mRN患者的生存时间62.5个月，仅N2淋巴结表达CK19、LUNX mRN患者的生存40.2个月，N1和N2均表达CK19、LUNX mRN患者的生存时间36.6个月，NI和N2均为表达CK19、LUNX mRN患者的生存时间为64.8个月。仅NI表达患者与仅N2表达及N1+N2均表达患者的生存时间差异有统计学意义，与未表达患者的差异不显著。仅N2表达患者的生存时间显著低于未表达患者，与N1和N2均表达患者的生存时间差异不显著。结论 CK19和LUNX mRNA可作为I期非小细胞肺癌患者淋巴结微转移的标记物，腺癌患者和ⅠB期患者淋巴结微转移率更高，N2淋巴结微转移是患者影响I期非小细胞肺癌患者预后的主要原因，N2淋巴结微转移患者的预后更差。

Ⅰ期非小细胞肺癌；ck19；特异性蛋白X mRNA；预后

肺癌是临床常见恶性肿瘤之一，也是我国城市人口恶性肿瘤死亡第一位原。虽然医学对肺癌认识不断深入，且临床治疗疗效取得显著进展，但是非小细胞肺癌(NSCLC)的生存率未明显增加，完全切除术后Ⅰ期NSCLC复发率高达25%-50%[1]。既往研究报道患者常规检查无法发现隐匿性微转移是术后复发率高的主要原因，根据NSCLC微转移判断肿瘤转移及原因对临床治疗和预后判断具有重要意义[2]。CK19是临床应用最广的标记物，目前缺乏诊断肺癌淋巴结微转移的转移性标记物，且多数研究认为单一标记物诊断的敏感性不高，临床需要根据多种标记物联合诊断，提高临床诊断的敏感性。LUNX是经nRNA差异显示技术分离的一个人类肺组织特异性基因，仅在上腭、鼻咽器官等呼吸道表达，具有明显的组织特异性。近年来部分研究报道LUNX mRNA作为检测肺外微转移指标的特异性和敏感度较高，可作为理想的检测NSCLC微转移分子标志物。本文以68例Ⅰ期NSCLC和20例肺炎假性肿瘤患者为研究对象，分析Ⅰ期NSCLC淋巴结中CK19和LUNX mRNA表达与微转移及预后的关系，现报道如下。

资料与方法

一、一般资料

收集2002年 1月1日-2008年 12月31收治的68例NSCLC患者患者，病理检测符合国际抗癌联盟(UICC)Ⅰ期诊断标准，ⅠA期35例，ⅠB期33例。入选标准：术前未行放化疗，采用根治性切除术，性淋巴结清扫并留取肺门旁、纵隔淋巴结。患者男性46例，女22例，年龄搜集范围18-65岁，平均(59.7±11.4)岁。病例类型：腺癌42例，鳞癌26例；同时选择 20例确诊为肺炎性假瘤病例为对照组，男性12例，女性8例。年龄18-64岁，平均(57.6±8.7)岁。

二、方法

将入选病例肿瘤组织、肺门旁(N1)、隆突下(N2)淋巴结蜡块，重新切片4-6张，分别做HE染色和免疫组化检测ck19、肺特异性蛋白X mRNA因子表达。具体操作：石蜡切片，脱蜡至水3% H2O2室温孵育5-10 min。蒸馏水清晰后使用PBS浸泡5 min，加入适当比例稀释一抗工作液，37 ℃孵育1-2 h或放置于4℃环境下过夜保存。使用PBS冲洗3次，2min/次。滴加二抗室温或37℃孵育20-30 min，再次使用PBS冲洗3次，2min/次。显色自来水冲洗、复染，脱水透明至封片。

术后当日开始随访，直至患者死亡或末次随访日。随访检查内容包括胸部普通CT、增强CT扫描、头颅CT及头颅核磁共振扫描、腹部B超或CT平扫、肾上腺B超，必要时行全身放射性骨扫描、结合放射性浓聚部位骨核磁共振扫描，并根据Ⅰ期NSCLC诊疗指南给予局部或全身放化疗等抗肿瘤综合治疗措施。术后1年内IA其患者定期接受随访和复查，未给予辅助放化疗治疗，ⅠB期患者接受放化疗或免疫治疗，未行放化疗患者定期接受随访及复查。术后随访1年后，以电话、电子邮件方式随。随访时间9个月-85个月，平均(37.5±28.6)个月，中位随访期3年。

三、统计学分析

使用SPSS21.0软件处理，技术资料使用频数和率(%)表示，两组间比较使用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、CK19、LUNX mRNA表达

68例Ⅰ期NSCLC患者肿瘤组织均有CK19、LUNX mRNA表达，肺炎性假瘤病例患者淋巴结未见CK19、LUNX mRNA表达。22例淋巴结可见CK19表达，腺癌17例，鳞癌5例；ⅠA期8例，ⅠB期14例。15例淋巴结可见LUNX mRNA表达，腺癌11例，鳞癌4例；ⅠA期5例，ⅠB期10例。腺癌患者淋巴结CK19、LUNX mRNA表达显著高于鳞癌患者，ⅠB期患者淋巴结CK19、LUNX mRNA表达显著高于ⅠA期患者。(见表1)。

表1 淋巴结CK19、LUNX mRNA表达情况

注：a表示鳞癌与腺癌患者CK19表达差异显著(t=2.574,P=0.024)；b表示鳞癌与腺癌患者LUNX mRNA表达差异显著(t=3.541,P=0.037)；c表示ⅠB期与IA其患者CK19表达差异显著(t=2.077,P=0.001)；d表示ⅠB期与ⅠA期患者LUNX mRNA表达差异显著(t=2.569,P=0.002)

二、N1和N2淋巴结CK19、LUNX mRNA表达

鳞癌患者与腺癌患者、ⅠB期与ⅠA期患者的N1淋巴结CK19、LUNX mRNA表达差异不明显，鳞癌患者与腺癌患者、ⅠB期与ⅠA期患者的N2淋巴结CK19、LUNX mRNA表达差异显著(P<0.05)。(见表2，3)。

表2 N1和N2淋巴结CK19表达比较

表3 N1和N2淋巴结LUNX mRNA表达比较

三、生存时间

仅N1淋巴结表达CK19、LUNX mRN患者的生存时间62.5个月，仅N2淋巴结表达CK19、LUNX mRN患者的生存40.2个月，N1和N2均表达CK19、LUNX mRN患者的生存时间36.6个月，NI和N2均为表达CK19、LUNX mRN患者的生存时间为64.8个月。仅NI表达患者与仅N2表达及N1+N2均表达患者的生存时间差异有统计学意义，与未表达患者的差异不显著。仅N2表达患者的生存时间显著低于未表达患者，与N1和N2均表达患者的生存时间差异不显著。(见表4)。

表4 生存时间比较

讨 论

微转移是指非血液系统恶性肿瘤在发展过程中，癌细胞播散并存活于血液循环、淋巴道、骨髓或组织器官内，但未形成转移结节，患者无临床表现。现有研究发现[3]，肺癌淋巴结存在肺癌在无N1转移情况下发生N2转移，且跳跃转移患者多为腺癌患者。但是肺癌淋巴结微转移诊断缺乏统一性标记物，而标记物需要具备特异性强和敏感性高两个特点，因而越来越多研究人员联合多个标记物检测肺癌微转移，以提高检测结果的敏感度[4]。本研究选择CK19和LUNX mRNA作为标记物，结果显示Ⅰ期NSCLC患者的肺癌组织均存在CK19和LUNX mRNA表达，未见假阴性及假阳性，表明CK19及LUNX mRNA的敏感性和特异性高。肺门及纵隔淋巴结检查显示CK19和LUNX mRNA的阳性率分别为16.2%、11.0%，符合既往研究报道的NSCLC淋巴结微转移率[5]。ⅠB期患者的CK19和LUNX mRNA表达率显著高于ⅠA期患者，表明IB和ⅠA期患者的淋巴结微转移率存在明显差异，ⅠB期淋巴结发生微转移的几率更高。在肺癌病例类型与淋巴结微转移关系方面，现有研究未对两者关系作出明确定论，部分研究报道肺癌类型与微转移无明显关系[6]，另一部分研究认为腺癌患者的微转移率更高[7]。本研究中腺癌患者的CK19和LUNX mRNA表达率更高，且显著高于腺癌(P<0.05)，提示CK19和LUNX mRNA表达情况可能用于判断肺癌病例类型。

NSCLC治疗及预后与肿瘤TNM分期关系密切，纵隔淋巴结是否存在转移是判断预后质量的重要标志。国外研究显示[8]，肺癌患者可能存在N2淋巴结转移，且多为侵袭性低分化腺癌患者，并且该研究认为N2淋巴结转移可导致预后不良。国外相似研究也报道早期NSCLC患者存在N2淋巴结转移患者的预后不佳，且发生复发和远处转移的几率高[9]。本研究将患者分为N1和N2淋巴结两组，结果显示腺癌患者N2淋巴结CK19和LUNX mRNA表达率高于鳞癌患者，提示微转移率更高；ⅠB期患者N2淋巴结表达CK19和LUNX mRNA表达率高于ⅠA期患者，提示ⅠB期患者N2淋巴结微转移更高。

越来越多研究证实微转移是预后不良的独立危险因素，淋巴结微转移是NSCLC患者预后不良的主要原因。国外研究报道肿瘤直径低于2 cm的肺癌患者仍存在N2淋巴结转移，N2转移提示患者可能预后不良[10]。本研究对N1和N2淋巴结微转移情况分析患者的生存时间，结果显示N1和N2淋巴结未表达患者的生存时间最长，N1和N2表达CK19和LUNX mRNA患者的生存期最短，且生存时间与N1表达和N1+N2表达患者的生存时间差异显著，仅N2表达患者的生存时间显著低于仅N1表达患者，结果表明N2淋巴结微转移患者的生存率更低，预后质量更差。但是N1+N2表达患者的生存时间虽然高于仅N2表达患者，但是差异不显著，提示，Ⅰ期NSCLC患者N1淋巴结转移对其生存率不影响。

综上所述，CK19和LUNX mRNA可作为Ⅰ期NSCLC患者淋巴结微转移的标记物，腺癌患者和ⅠB期患者淋巴结微转移率更高，N2淋巴结微转移是患者影响Ⅰ期NSCLC患者预后的主要原因，N2淋巴结微转移患者的预后更差。

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Correlation of CK19, lung specific protein mRNA X expression with micro metastasis and prognosis in primary non small cell lung cancer

LUWei,LIANGKe-cheng,WUHan-gang,LIANGXin-mei,TAN

HaotheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiScienceandTechnologyUniversity,Liuzhou,Guangxi545000,China

Objective To study the correlation between the expression of cell keratin 19 (CK19), non specific protein X (LUNX) mRNA expression and prognosis in patients with stage I non-small cell lung cancer. Methods 68 cases after thoracic surgery pathologically confirmed as stage I non small cell lung cancer patients were selected as the observation group, and 20 cases diagnosed as inflammatory pseudotumor as the control group. Their tumor tissue and paraffin block near the door of pulmonary (N1) and mediastinal lymph (N2) were given HE staining and immunohistochemical detection to detect CK19 and LUNX mRNA expression. Results The expression of CK19 and LUNX mRNA was detected in tumor tissues of the observation group, but it wasn't detected in pulmonary inflammatory pseudotumor patients.CK19 expressed in 22 cases of lymph node, 17 cases of adenocarcinoma, 5 cases of squamous cell carcinoma, 8 cases at stage IA, and 14 cases at stage IB. LUNX mRNA expressed in 15 cases of lymph node, 11 cases of adenocarcinoma, 4 cases of squamous cell carcinoma, 5 cases at stage IA, and 10 cases at stage IB. The expression of CK19 and LUNX mRNA was significantly higher in lymph nodes of patients with adenocarcinoma than in patients with squamous cell carcinoma, and stage IB lymph node higher than stage IA. There was no significant difference in N1 lymph node of CK19 and LUNX mRNA expression between squamous cell carcinoma and adenocarcinoma patients, stage IB and stage IA patients. There were significant differences in N1 lymph node of CK19 and LUNX mRNA expression between squamous cell carcinoma and adenocarcinoma patients, stage IB and stage IA patients (P<0.05). The survival duration of only N1 lymph node expression of CK19 and LUNX mRNA was 62. 5 months, and 40.2 months for only N2 lymph node expression of CK19 and LUNX mRNA, and 36.6 months for N1 and N2 expressed CK19 and Lu Nx mRNA. The survival time of Ni and N2 expression of CK19 and LUNX mRNA was 64.8 months. Conclusion CK19 and LUNX mRNA can be as markers for stage I non small cell lung cancer micrometastasis in lymph nodes of patients, and patients with adenocarcinoma patients at stage IB have higher transfer rate. N2 lymph node micrometastasis is main reason for the prognosis of patients with small cell lung cancer (NSCLC) and N2 lymph node micrometastasis prognosis is worse.

stage I non-small cell lung cancer; CK19; specific protein X mRNA; prognosis

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.05.008

广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研课题基金(No Z2014580)

545000 广西 柳州，广西科技大学第一附属医院

2016-09-26]