宠物食品中肉毒杆菌LAMP检测方法的研究

陈宇飞，杨 柳，杜德伟，王 磊，孙如一，隋 馨

（1.吉林工商学院食品工程学院，吉林长春 130507； 2.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春 130118；3.吉林省医疗器械检验所，吉林长春 130062）

宠物食品中肉毒杆菌LAMP检测方法的研究

陈宇飞1，杨 柳1，杜德伟1，王 磊1，孙如一2，隋 馨3

（1.吉林工商学院食品工程学院，吉林长春 130507； 2.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春 130118；3.吉林省医疗器械检验所，吉林长春 130062）

为研究宠物食品中肉毒杆菌环介导恒温扩增（LAMP）检测方法，本试验根据肉毒杆菌特异性基因片段（NtnH）设计1组引物，应用LMAP技术，通过扩增肉毒杆菌和14种非肉毒杆菌基因片段，对建立的LAMP反应体系进行最佳温度及反应时间筛选试验、采用浊度法和染色法进行特异性试验以及与PCR对比的敏感性试验。结果表明：建立的LAMP反应体系只扩增肉毒杆菌基因，特异性良好；体系最佳反应温度为64℃，最佳反应时间为60 min；最低检测浓度为0.0001 pg/μL，比PCR高出10倍。本试验所建立的方法特异性好、灵敏度高，反应时间短，适用于宠物食品中肉毒杆菌的检测。

肉毒杆菌；LMAP技术；PCR；浊度法

肉毒中毒主要是由肉毒杆菌（Clostridium Botulinum）产生的肉毒神经毒素引起的一种病死率极高的周围神经麻痹性疾病[1]。肉毒杆菌按其产生毒素的血清学特性可分为A～G 7个型，其中引起人肉毒中毒的主要是A、B、E 3个型，且不同的国家及地区肉毒中毒的型别具有地域性差别，我国以A型的发生频率居首位[2]。肉毒毒素对酸的抵抗力特别强，胃酸溶液24 h内不能将其破坏，继而可被胃肠道吸收，损害身心健康[3]。纯的1 mg肉毒毒素能杀死2亿只小鼠，毒性极大。

宠物食品专门为宠物、小动物提供，是介于人类食品与传统畜禽饲料之间的高档动物食品[4]。若宠物食品及其原料污染了肉毒杆菌，其产生的菌毒素A将会对宠物造成极大的伤害。近些年，宠物市场逐步兴起，因此宠物食品中肉毒杆菌的检测对宠物保健行业的发展十分重要。

Notomi等[5]在2000年发明环介导恒温扩增技 术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP），可以在等温条件下实现核酸扩增。LAMP技术的反应原理是根据序列保守区域设计的1对外引物、1对内引物和1对环引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，在60～65℃条件下60 min内，大量合成目标DNA 的同时，伴随有副产物白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性强。核酸扩增过程是在恒温条件下进行，检测时间大大缩短，反应快速敏感。目前，LAMP技术在细菌和病毒检测、耐药基因检测[6]、寄生虫检测[7]、胎儿性别鉴定等方面被广泛应用。黄金海等[8]研究了食品中沙门菌LAMP 快速检测方法，可用于沙门氏菌污染食品的快速检测；孙园园等[9]建立了动物饲料中沙门菌LAMP快速诊断方法，对24份样品的3次检测结果与国标法完全一致；苑昊[10]将LAMP技术与微流控技术结合，检测环境中的金黄色葡萄球菌，使DNA的释放、扩增以及结果的观察集成在一个长宽均为厘米级别的芯片中，完成高通量的检测。本研究根据肉毒杆菌特异性基因序列，建立宠物食品中肉毒杆菌LAMP快速检测方法，专门对宠物食品及原料进行特异性检测，对肉毒杆菌的监测具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 菌种 菌种来源于北京博奥晶典生物技术有限公司，菌种的活化、核酸提取等在该公司的二级病原微生物实验室完成。

1.2 试剂与仪器 LAMP法荧光检测试剂盒（DNA Amplification Kit）产自日本荣研化学株式会社；LAMP反应管（Reaction Tube）产自日本荣研化学株式会社；荧光染料（Fluorescent Detection Reagent，FD）产自日本荣研化学株式会社；Chelex-100、甜菜碱来自Sigma 公司；氯化锰、硫酸镁、氯化钾、氢氧化钠、EDTA、硫酸铵购自国药集团化学试剂有限公司；Tris-HCl来自上海生科生物科技有限公司； Triton X-100来自北京美莱博医学科技有限公司；dNTP来自Pharmacia公司；NP-40来自Fluka公司；2×Tap MIX试剂盒产自天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖来自Amresco公司。

La-320C实时浊度仪来自日本荣研化学株式会社；CHB-100HB-100型恒温金属浴来自杭州博日科技有限公司；NanoDrop ND-1000型分光光度计来自凯乐博（北京）科技发展有限公司；ST5型凝胶成像仪来自VILBER公司；ETC811型基因扩增仪来自苏州东胜兴业科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 模板的制备 使用TIANGEN 核酸提取试剂盒，按照试剂盒说明书提取细菌基因组 DNA。其中通过对肉毒杆菌基因序列进行生物信息学分析，自行设计肉毒杆菌靶基因序列，并对此靶序列在美国NCBI数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）进行比对检索，其特异性较好。根据该基因序列，人工合成该基因片段。

1.3.2 LAMP反应引物的设计 根据LAMP引物设计软件网址（http://primerexplorer.jp/e/）进行LAMP引物设计，将待扩增的DNA 分为6个独立区域，根据这6个区域分别设计LAMP 反应所需引物（内引物FIP和BIP、外引物F3和B3、环引物LB和LF），设计LAMP引物扩增靶基因：

肉毒杆菌基因序列片段及引物合成由上海生工生物科技有限公司完成。

1.3.3 LAMP 反应体系的建立 25 μL反应混合物包括：12.5 μL 2×反应液(终反应液离子浓度：20 mmol/L Tris-HCl ,pH为 8.8，10 mmol/L KCl，10 mmol/L（NH4）2SO4，0.1% Triton X-100，0.8 mol/L 甜菜碱，8 mmol/L MgSO4，1.4 mmol/L dNTP)，1 μL 8 U Bst DNA 聚合酶，2.6 μL引物混合液（终引物浓度：40 pmol/L FIP 和BIP，5 pmol/L F3 和B3，20 pmol/L LB和LF），2 μL引物模板，6.9 μL双蒸水补齐 。将混合物置于60～65℃恒温反应60 min左右。以双蒸水为阴性对照。

表1 试验用对照菌种

1.3.4 LAMP检测方法 浊度法的反应过程:

其中，Mg2P2O7为焦磷酸镁，为白色沉淀。利用实时浊度仪LA-320c进行实时测量，每隔6 s测定反应管的浊度，绘制成曲线来判断反应的阴阳性。

荧光染色法：钙黄绿素是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性时为橙色，阳性时为绿色。

1.3.5 最佳温度筛选试验 利用建立的LAMP反应体系，对引物进行最佳温度筛选试验，设置温度从60～67℃，梯度为1℃，根据起峰时间和出峰高点，测定LAMP最佳反应温度。

1.3.6 特异性试验 利用建立的LAMP反应体系，肉毒杆菌基因组为阳性样品，以福氏志贺氏菌、大肠埃希氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、蜡样芽孢杆菌、肺炎链球菌、屎肠球菌、副溶血性弧菌、表皮葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、乳房链球菌等14株菌（表1）以及双蒸水样品作为对照，进行特异性试验。

1.3.7 LAMP 、PCR方法敏感性对比试验 为了验证LAMP 方法的检测灵敏度，以肉毒杆菌基因组为检测对象，定量后将总DNA进行10 倍稀释度稀释，使得最终核酸浓度分别为1、100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001 pg/μL，并以双蒸水作为阴性对照。然后进行LAMP反应，分别采用染色法和浊度法来检测结果。

将10倍梯度稀释的基因组用于PCR反应。引物为F3、 B3。PCR 反应总体积25 μL：1 μL模板、10 pmol各引物、12.5 μL 2×Taq MIX。扩增循环条件：95℃预变性5 min，之后95℃变性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸30 s，共30个循环，最后延伸7 min。取PCR 产物10 μL，在1%含EB琼脂糖凝胶电泳上120 V 电泳35 min，在凝胶成像系统下照像检测。

2 结果与分析

2.1 最佳温度筛选 由图1可以看出，在60～67℃时，都能发生LAMP反应。但不同温度下，LAMP反应的起峰时间和出峰高点不同。随着温度的升高，呈现出峰时间先缩短，之后再增长的趋势。当温度为64℃时，出峰时间最短（18 min）。该温度下，当LAMP反应60 min时，出峰最高。因此，将最佳温度定在64℃，反应时间定为60 min。

图1 最佳温度筛选试验结果

2.2 特异性试验结果 由图2可以看出，只有肉毒杆菌基因组样品发生了LAMP反应，其他14个菌种的核酸及阴性对照样本均未发生LAMP反应。因此，可以确定本试验建立的LAMP反应体系特异性良好。由图3也可以看出，只有第15号（肉毒杆菌）离心管发生了颜色反应，即具有较好的特异性。

图2 特异性试验结果（浊度检测）

2.3 最佳引物的敏感性试验结果及与PCR的比较将10倍梯度稀释的肉毒杆菌基因组模板用于LAMP反应，检测结果见图4～5。浊度法与染色法实验结果一致，LAMP最低检测浓度为0.0001 pg/μL。由图6可知，PCR最低检测浓度为0.001 pg/μL。可见，LAMP反应的敏感性要优于PCR反应。

3 结 论

图3 特异性试验结果（目视荧光检测）

图4 最佳引物的敏感性试验结果（浊度检测）

图5 最佳引物的敏感性试验结果（目视荧光检测）

图6 PCR敏感性的实验结果

本文研究了宠物食品中肉毒杆菌LAMP检测方法。根据肉毒杆菌特异性基因序列，人工合成肉毒杆菌基因片段，以14种食品中常见细菌作对照，对建立的LAMP反应体系进行温度筛选试验、最佳反应时间试验、采用浊度法和染色法进行特异性试验以及与PCR对比的敏感性试验。结果表明，建立的LAMP反应体系只扩增肉毒杆菌，对其他14种食品中常见的细菌均没有扩增，特异性良好；体系最佳反应温度为64℃，最早出峰时间为18 min，最佳反应时间为60 min；最低检测浓度为0.0001 pg/μL，比PCR（0.001 pg/μL）高出10倍。本方法灵敏度高、特异性强、操作简便，可以用来检测宠物食品中的肉毒杆菌。

[1] 赵思俊, 李雪莲, 曹旭敏, 等. 肉毒杆菌及肉毒毒素研究进展[J]. 中国动物检疫, 2013, 30 (8) :36-39.

[2] 左庭婷, 端青. 我国及部分国家B型肉毒毒素的中毒情况[J]. 生物技术通报, 2010, 21(1):103-106.

[3] 贺彩红. A型肉毒毒素治疗三叉神经痛及其伴发焦虑、抑郁及睡眠障碍临床研究[D]. 郑州:郑州大学, 2013.

[4] 李钰, 王存芳. 宠物粮的特性及其发展研究[J]. 饲料研究, 2015, (24):9-12.

[5] Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Res , 2000, 28(12): 63.

[6] Liu W, Zou D, Li Y, et al. Sensitive and rapid detection of the new delhi Metallo-Beta-Lactamase gene by Loop-Mediated isothermal amplification[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50 (5):1580-1585.

[7] Li X, Liu W, Wang J, et al. Rapid detection of Trichinella spiralis larvae in muscles by loop-mediated isothermal amplif i cation [J]. Int J Parasitol, 2012, 42(12):1119-1126.

[8] 黄金海, 孙跃辉, 陈瑞, 等. 食品中沙门氏菌 LAMP 快速检测方法的建立[J]. 天津大学学报, 2012 , 45(5) :468-472.

[9] 孙园园, 赵鹏. 动物饲料中沙门氏茵环介导等温扩增(LAMP) 快速诊断方法的建立[J] . 中国畜牧兽医, 2012, 39(1):32-36.

[10] 苑昊. 基于微流控技术的环境中金黄色葡萄球菌的检测研究[D]. 上海:复旦大学, 2014.

Study on Detection Method for LAMP Technique in Clostridium Botulinum of Pet Food

CHEN Yu-fei1, YANG Liu1, DU De-wei1, WANG Lei1, SUN Ru-yi2,SUI Xin3
(1.Department of Food Engineering, Jilin Business and Technology College, Jilin Changchun 130507, China; 2. College of Life Science, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118, China; 3. Jilin Medical Instrument Inspection Institute, Jilin Changchun 130062,China)

The detection method for LAMP technique in Clostridium botulinum of pet food was studied in the paper. A set of primers was designed according to the specif i c gene(NtnH)fragments of Clostridium botulinum. Through ampilifying gene fragments of Clostridium botulinum and 14 nonClostridium botulinum, screening test of optimum temperature and response time on LAMP reaction system, specif i c test by using nephelometry and staining method, sensitivity test of that compared to PCR were studied. The result demonstrated that LAMP only amplif i ed gene of Clostridium botulinum, and had a good specif i city. The optimum response temperature of the system was 64℃, and the optimum response time was 60 min. The minimum detectable concentration was 0.0001 pg/µL, which was 10 times higher than PCR. The method established by the study had a good specificity and high sensitivity and short response time, which was adapt to the detection for Clostridium botulinum of pet food.

Clostridium botulinum; LAMP technique; PCR; Nephelometry

TS207.4

A

10.19556/j.0258-7033.2017-04-127

2016-11-02；

2016-11-15

中国农业部重点实验室2016开放基金；吉林省科技厅2015年重点科技攻关项目（20150204064NY）

陈宇飞（1968-），男，教授，本科，主要从事食品安全检测研究，E-mail:254447088@163.com