绵羊Lpin2基因CDS区克隆与生物信息学分析

焦小丽，景炅婕，乔利英，李留安，李宝钧，刘文忠*

（1. 山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801；2. 天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384）

绵羊Lpin2基因CDS区克隆与生物信息学分析

焦小丽1,2，景炅婕1，乔利英1，李留安2，李宝钧1，刘文忠1*

（1. 山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801；2. 天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384）

本研究应用RT-PCR、5'-RACE、TA克隆技术获得绵羊Lpin2基因CDS区，并进行相关生物信息学分析，为其遗传特性及编码蛋白功能机制的研究提供基础数据。结果获得绵羊Lpin2基因2 754 bp，包括84 bp的5'UTR和2 670 bp的CDS区，编码889个氨基酸。生物信息学分析编码蛋白lipin2属不稳定的中性亲水脂溶性蛋白，存在跨膜域、2个O-糖基化位点和89个磷酸化位点，没有信号肽，定位于细胞质或细胞器中。存在由细胞质活性氧(ROS)主导的氧化还原机制形成的二硫键。二级结构包含高比例的环(80.54%)。蛋白N-末端和C-末端分别含有保守结构域Lipin_N和LSN2。绵羊与山羊、家牛、羊驼、猪、家犬、灵长类与啮齿类动物以及原鸡lipin2氨基酸序列同源，系统进化与其亲缘关系远近一致， Lpin2基因编码区进化保守。绵羊lipin2与lipin1氨基酸序列相似性相对较低(66%)，可能与其有差异的功能活性有关。

绵羊；Lpin2基因；克隆；生物信息学

脂素(Lipins)是双向调控脂肪代谢的关键调控蛋白，在脂质代谢中具有Mg2+离子依赖的磷脂酸磷酸酶(PAP)活性，催化磷脂酸(PA)生成甘油二酯(DAG)，还可作为转录共激活因子调控脂质相关基因的表达[1,2]，其编码基因突变可导致脂质稳态及代谢异常[3]，哺乳动物lipins家族蛋白由lipin1、lipin2与lipin3 3个成员组成，分别被Lpin1、Lpin2与Lpin3基因编码[1]。2个相近的蛋白lipin2和lipin3与lipin1的氨基酸序列相似性为44%～48%[4]。包括低等生物酵母到哺乳动物在内的整个发育系统lipin成员均含有高度保守的功能结构域N-LIP(氨基端)和C-LIP(羧基端)[5]，然而3个lipin成员在亚细胞定位[5]、PAP酶活性[6]、分子调控等方面存在差异[7]。畜禽lipins编码基因多态性与背膘厚、大理石纹、眼肌面积等肉质性状显著关联[8-9]。目前对lipin1的研究较多， lipin2与lipin3尚缺乏深入研究[1]，绵羊Lpin2基因尚未见报道。本研究拟采用RT-PCR、5'-RACE、TA克隆技术获得绵羊Lpin2基因CDS区，应用生物信息学方法对其核酸及编码氨基酸序列进行预测分析，为Lpin2基因在绵羊中的遗传特性及蛋白功能活性的研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 组织样品来自10月龄广灵大尾羊（山西省浑源县）的肾周脂肪组织。绵羊屠宰后，用RNA酶灭活的剪刀、镊子剪取组织，置于无RNA酶的冻存管并迅速投入液氮中，随后-80℃冰箱超低温保存。

1.2 主要试剂 RNAiso Plus总RNA提取试剂、PrimeScriptTM RT Master Mix反转录试剂盒、pMD18-T克隆载体试剂盒、TaKaRa LA Taq with GC Buffer、氨苄青霉素(Amp)、X-Gal、IPTG、胰蛋白胨、酵母提取物购自宝生物工程（大连）有限公司；M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、0.1～10 kb DNA Ladder Marker、超级感受态细胞制备试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，5'RACE Systemfor Rapid Amplification of cDNA Ends为Invitrogen产品。异戊醇、Tris饱和酚、溴酚蓝、DEPC、无水乙醇、异丙醇、三氯甲烷、琼脂糖购自北京天根生化科技有限公司。

1. 3 实验方法

1.3.1 总RNA提 取及RT-PCR反 应 根据RNAiso Plus总RNA提取试剂说明书提取总RNA，核酸蛋白测定仪ND-100检测RNA的浓度及纯度，1.2%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量及完整性。按照试剂盒说明书反转录合成cDNA，Oligo dT引物序列为5'-GGTCCTTTCTT GTATCAGCTCGCCCT-3'，cDNA置于-20℃保存备用。

1.3.2 引物设计 参照GenBank绵羊Lpin2基因 预 测 序 列 (登 录 号： XM_004020631.2，XM_012103527.2)，用Primer Premier 5.0生物软件设计PCR扩增引物（P1与P7产物）以及2条5′RACE巢式接头引物、GSP1和GSP2特异性引物（P2～P6、P8产物）。引物序列及产物大小如表1所示。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3 PCR扩增 分别使用Taq酶和LA Taq酶扩增绵羊Lpin2基因CDS片段。扩增P1产物的反应总体系为15μL：上下游引物各0.5 μL，10×Taq Buffer 1.5 μL，dNTP(2.5 mM)1.2 μL，cDNA模板1 μL，Taq酶0.2 μL，RNase-Free ddH2O 10.1 μL；扩增P7产物的反应总体系为25 μL：上下游引物各0.5 μL，2×GC Buffer I 12.5 μL，dNTP(2.5 mM)4 μL，cDNA模板1 μL，LA Taq酶0.2 μL，RNase-Free ddH2O 6.3 μL。PCR反应条件为95℃预变性3 min，94℃变性30 s，50～60℃退火30 s，72℃延伸60～120 s，33～35个循环，72℃修复延伸6～7 min。应用巢式PCR扩增绵羊Lpin2基因CDS片段（P2～P6、P8产物），操作步骤参照5' RACE说明书。第一轮反应体系为25 μL，包括12.5 μL的2×GC Buffer I，0.5 μL的AAP，0.5 μL 的GSP1引 物（R1/ R3/R5/R7/R9/R13），1 μL cDNA模 板，4 μL dNTP，LA Taq酶 0.2 μL，RNase-Free ddH2O 6.3 μL；第二轮反应体系为50 μL，包括25 μL的2×GC Buffer I，1 μL的AUAP，1 μL的GSP2(R2/R4/R6/R8/R10/R14)，1 μL cDNA模板（第一轮PCR稀释产物），8 μL dNTP，LA Taq酶0.5 μL，RNase-Free ddH2O 12.5 μL。反应条件为95℃预变性3 min，94℃变性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸1 min，33个循环，最后72℃修复延伸7 min。

1.3.4 目的片段TA克隆与鉴定 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR目的片段，与pMD18-T克隆载体在16℃条件下连接过夜，连接反应总体系为10 μL：Solution I 4 μL，PCR回收产物5 μL，载体0.2 μL，ddH2O 0.8 μL。连接产物转化步骤如下：10 μL连接液转化至100 μL感受态细胞，转化后加入400 μL 2×YT无抗生素液体培养基，37℃条件下复苏1 h。将复苏后的菌液均匀涂布在预先用IPTG和X-gal涂布的氨苄青霉素（Amp）平板上，倒置培养过夜。次日，用灭菌枪头挑取白色单一菌落于装有7 mL含Amp的液体培养基中，37℃培养箱振荡培养7～8 h，之后进行菌液PCR鉴定后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3.5 生物信息学分析 应用DNAMAN和Contig软件比对拼接序列片段， ApE软件预测开放阅读框（ORF）并翻译编码区成氨基酸序列。应用 Protparam、SCRATCH Protein Predictor、SignalP4.0、TMHMM Server v.2.0和 TMpred Server、NetOGlyc 3.1、NetNGlyc 1.0、NetPhos 2.0在线软件分别预测蛋白质理化性质、二硫键、信号肽、跨膜域、O-糖基化位点、N-糖基化位点以及磷酸化位点。应用PredictProtein在线软件预测蛋白质二级结构。应用NCBI中的CDD数据库(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测蛋白质功能结构域，NCBI中的Blastp比对氨基酸序列。应用MEGA5.0软件基于遗传距离的邻接法(NJ)构建遗传距离进化树。

2 结 果

2.1 总RNA检测 核酸蛋白测定仪测定总RNA的OD260/280在1.8～2.0，浓度在700～900 ng/μL，电泳检测到清晰完整的28S rRNA和18S rRNA条带(图1)，说明RNA纯度及浓度较高，完整性较好，RNA无降解及无DNA、蛋白质污染，适合用做RT-PCR反应。

图1 总RNA琼脂糖凝胶电泳检测

图2 绵羊Lpin2基因CDS区PCR扩增产物

2.2 绵羊Lpin2基因PCR扩增与克隆测序 电泳检测RT-PCR扩增产物为单一特异性条带，片段大小与预扩增片段大小一致(图2)。经测序获得P1(815 bp)、P2(268 bp)、P3(803 bp)、P4(539 bp)、P5(421 bp)、P6(435 bp)、P7(674 bp)、P8(247 bp)扩增片段，比对拼接后得到绵羊Lpin2基因2 754 bp，包含84 bp的5'UTR 以及2 670 bp的ORF，序列比对发现ORF与GenBank预测的转录本X3(登录号：XM_012103527.2)CDS区相一致，编码889个氨基酸，核酸序列提交至GenBank(登录号：KX097051)。

2.3 绵羊lipin2蛋白序列分析及结构预测

2.3.1 理化性质 绵羊lipin2由889个氨基酸组成，分子式为C4358H6794N1192O1362S26，分子量为98 512.6 D，理论等电点(pI)为5.54，为中性蛋白质。氨基酸残基中Ser(10.3%)频率最高，Met(1.3%)频率最低，含有14个Cys。消光系数(M-1cm-1γ=280 nm)为115 125，不稳定系数为54.68，属不稳定类蛋白质。在哺乳动物网织红细胞内的半衰期为30 h。脂溶指数为71.19，平均亲水性为-0.613，属亲水性脂溶蛋白。

2.3.2 信号肽、跨膜域与二硫键 信号肽预测表明绵羊lipin2前70个氨基酸的C-max(0.109)、S-max(0.163)、Y-max(0.109)均小于阈值0.5，表明该蛋白没有信号肽。TMHMM软件预测该蛋白不存在跨膜结构域，TMpred软件预测存在507～528氨基酸膜内到膜外，以及511～529氨基酸膜外到膜内的双向跨膜，分值分别为609和628，大于500，认为该蛋白有2次跨膜。预测绵羊lipin2蛋白14个Cys中，12个Cys形成6对二硫键。

表1 绵羊Lpin2基因PCR引物序列及产物长度

2.3.3 糖基化和磷酸化 预测绵羊lipin2存在潜在的O-糖基化和N-糖基化位点，Thr430和Ser589的O-糖基化潜力值分别为0.532和0.521，Asn200和Asn839的N-糖基化潜力值分别为0.529和0.577，均大于阈值0.5。预测绵羊lipin2存在89个潜在的磷酸化位点，分别为67个Ser、12个Thr和10个Tyr磷酸化位点，潜力值均大于0.5。

2.3.4 结构域与高级结构 预测绵羊lipin2蛋白N-末端(N-LIP，1～106氨基酸)和C-末端(C-LIP，630～855氨基酸)分别存在Lipin_N和LNS2（Lipin/ Ned1/Smp2）超家族结构域(图3)。Lipin_N是小鼠lipin1调节脂肪代谢的关键结构域，LNS2具有卤酸脱卤酶超家族(HAD_like)中Mg2+依赖性的PAP酶活性，结构上包括PAP酶活性模序DXDXT以及转录共调控LXXIL模序，这2种结构域是lipin家族蛋白共有的[4]，表明lipin家族蛋白功能的保守性。PredictProtein软件中的REPROFSec程序预测绵羊lipin2包含10.80%的α螺旋(Helix, H)，8.66%的β折叠(Extended Strand, E)和80.54%的环(Loop)。PROFAcc程序预测氨基酸残基溶剂可及性，发现埋藏态(buried)为26.21%，中间态(Intermediate)为6.41%，暴露态(Exposed)为67.38%。ISIS程序预测168、205、312、390、510～511、547、664、794氨基酸为蛋白质结合位点。MD程序预测1、91～96、104～259、265～450、456、469～477、528～627、629、633～634、861～863、882～884、886 氨 基 酸为无序结构区域。且发现α螺旋和β折叠以及氨基酸残基溶剂可及性的埋藏态主要位于Lipin_N和LSN2保守功能域，构成了该蛋白二级结构空间折叠的结构基础，而高比例的环、氨基酸残基溶剂可及性的暴露态以及大部分无序结构位于非保守序列(图4)。

图3 绵羊lipin2蛋白保守结构域预测

图4 绵羊lipin2蛋白二级结构预测

2.3.5 序列相似性比对及聚类分析 绵羊与山羊、家牛、羊驼、猪、家犬及灵长类与啮齿类物种lipin2氨基酸序列相似性在90%以上，与原鸡的相似性也高达87%，与所有比对物种氨基酸序列一致性在80%以上(表2)，lipin2发育树与生物进化物种树基本一致(图5)。绵羊lipin1(AFR45924.1)与lipin2(XP_011958917.1)氨基酸序列一致性和相似性分别为53%和66%，同一家族lipin蛋白氨基酸序列相似性较低，可能与其有差异的功能活性有关。

3 讨 论

3.1 绵羊Lpin2基因序列及编码蛋白理化性质 小鼠Lpin2定位于MMU 17，编码893个氨基酸；大鼠Lpin2定位于RNO 9，编码894个氨基酸，人Lpin2基因定位于HAS 18p，编码896个氨基酸。猪Lpin2基因位于SSC 6q24-(1/2)q31，编码891个氨基酸，以上物种lipin2均含有20个外显子。本研究得到绵羊Lpin2基因2 670 bp 的CDS区，定位于OAR23，编码889个氨基酸，含有20个外显子，与上述物种相接近。预测分析该蛋白pI为5.54，分子量99.51 ku，为中性亲水性蛋白。蛋白质半衰期与其稳定性密切相关，一般而言，半衰期长则蛋白质稳定性高[10]。绵羊lipin2具有较长的半衰期，但却属于不稳定蛋白，这一特性是否与其双重功能活性有关值得研究。

表2 绵羊与11种物种lipin2氨基酸序列一致性与相似性比对

图5 12个物种lipin2氨基酸序列系统进化树

3.2 蛋白质结构与功能 基于TMpred软件预测绵羊lipin2存在2次跨膜。研究表明lipin蛋白定位于细胞质，可转移至细胞膜发挥PAP酶活性，也可定位于细胞核发挥转录共调控活性[1]，推测该蛋白可能存在跨膜结构域，且不存在信号肽，不是分泌蛋白，定位于细胞质或细胞器中。N-糖基化发生在粗面内质网(ER)和高尔基体中[11]，由于没有信号肽，不可能进入ER发生N-糖基化，推测N-糖基化位点可能不存在。真核生物最普遍的是发生在高尔基体和ER中的O-GalNAc(O-乙酰半乳糖胺)。研究发现，大量定位于细胞质和细胞核的蛋白存在单低聚糖O-GlcNAc(O-乙酰葡萄糖胺)方式，这些O-GlcNAc常发生在Ser/Thr残基并与磷酸化竞争[12]，这种竞争性修饰对转录尤其重要[13]。预测绵羊lipin2存在Thr430和Ser589O-糖基化位点，且分析发现2个O-糖基化位点位于蛋白无序结构区域，而大部分的O-GalNAc和O-GlcNAc出现在无序结构中[14]。由于预测绵羊lipin2可能位于细胞质或细胞器，推测该蛋白可能在细胞质或细胞核中发生O-GlcNAc，并与磷酸化存在竞争关系，参与转录调控。磷酸化调控lipins亚细胞定位进而调控其功能的发挥。高度磷酸化的lipin1在细胞质中富集，去磷酸化的lipin1在ER/核膜上富集，肝细胞质中检测到了磷酸化的lipin2[1]。这与磷酸化调控蛋白质亚细胞定位相一致[15]。预测绵羊lipin2存在Ser、Thr和Tyr共89个磷酸化位点，包括Ser 106。Ser106是哺乳动物lipins和酵母Pah1p/Smp2p的保守位点，位于Lipin_N结构域内，是胰岛素刺激lipin1和lipin2磷酸化的主要位点[1]。预测发现大多数磷酸化位点位于该蛋白无序结构区域，而无序结构是磷酸化的热点区域[16]。因此绵羊lipin2可能存在多个磷酸化位点，对细胞定位和功能活性发挥调控作用。二硫键影响蛋白质的正确折叠和结构稳定性。真核生物二硫键的氧化发生在ER腔，然而研究发现少数定位于还原性细胞浆中的蛋白质也会受细胞氧化还原状态的影响形成暂时的二硫键，从而影响蛋白质功能与性状。由细胞质线粒体产生的活性氧(ROS)参与细胞表面蛋白质二硫键的形成，并通过这一新机制调节蛋白质的折叠与转运[17]。因此认为两类亚蛋白质组(Sub-proteomes)构成二硫化物蛋白质组，即一个结构基团和一个氧化还原基团，后者对于细胞有直接的功能活性，并且是对氧化还原很敏感的基团[17]。预测绵羊lipin2 14个Cys中形成6对二硫键，由于预测不含信号肽，不可能进入ER内完成巯基氧化二硫键的形成，此外预测绵羊lipin2为不稳定蛋白，可能不存在结构性二硫键。推测绵羊lipin2定位于细胞质或细胞核中，接受来自细胞质线粒体产生的ROS，氧化Cys生成二硫键。是否形成二硫键及其与蛋白功能的关系尚待研究证实。

3.3 Lipin2氨基酸序列相似性及不同种群遗传分化绵羊与山羊、家牛等11种脊椎动物lipin2氨基酸序列相似性较高，绵羊与比对物种lipin2氨基酸序列同源，系统发育树与生物进化的物种树以及动物分类学基本一致，表明该基因在进化上高度保守，这与有重要功能的蛋白质氨基酸替换速率较低[18]相一致。绵羊lipin1和lipin2氨基酸序列相似性较低(66%)，比对发现保守区域(N-末端和C-末端)相似性较高，非保守序列相似性较低。研究表明3个lipin蛋白在 亚细胞定位[5]、PAP酶活性[6]以及转录共激活调控机制[7]等存在较大差异。且二级结构预测发现lipin2的蛋白质结合位点大多位于非保守序列，认为低相似性的非保守序列可能对各lipin成员具有特定调控作用，导致同一物种lipin成员间功能活性的差异。

4 结 论

绵羊Lpin2基因CDS区全长2 670 bp，编码889个氨基酸组成的不稳定中性亲水性蛋白。预测绵羊lipin2没有信号肽，存在2次跨膜，定位于细胞质或细胞器中。预测存在2个O-糖基化位点和89个磷酸化位点，预测存在二硫键。绵羊与山羊、家牛等11种脊椎动物lipin2氨基酸序列同源，Lpin2基因编码区生物进化高度保守。

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Cloning and Bioinformatics Analysis on CDS of Lpin2 Gene in Sheep

JIAO Xiao-li1,2, JING Jiong-jie1, QIAO Li-ying1, LI Liu-an2, LI Bao-jun1, LIU Wen-zhong1
( 1. College of Animal Science and Technology, Shanxi Agricultural University, Shanxi Taigu 030801, China; 2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)

In this study, the CDS region of sheep Lpin2 gene was cloned by using the RT-PCR, 5'-RACE, TA cloning techniques and the bioinformatics analysis was performed, so as to provide the basic data for further exploring the genetic characters of this gene and the function mechanism of its encoding protein. As a result, the 2 754 bp length Lpin2 gene was obtained by cloning, including the 84bp length 5'UTR and the 2 670bp length CDS regionand encoding 889 amino acids. Bioinformatics analysis revealed that the encoding protein of sheep lipin2 was an unstable, neutral and hydrophilicfat-soluble proteinwith transmembrane domains, two potential O-glycosylation sites and 89 phosphorylation sites, while without signal peptide, resides in the cytosol or organelle. The potential disulphide bonds may be formed by the reactive oxygen species (ROS) produced by mitochondria in cytoplasm by the mechanism of cell redox status regulation. The secondary structure of lipin2 was mainly loop (80.54%). Two evolutionarily conserved domains of Lipin_N and LSN2 were located at the N- terminal and C-terminal of lipin2, respectively. Amino acid sequences of lipin2 were homologous between sheep and goat, cattle, alpaca, pig, dog, primates and rodents as well as chicken, and phyletic evolution was the same as their genetic relationship, which suggested that the coding region of Lpin2 gene was conservative in the course of evolution. The amino acid sequence similarity was low between lipin1 and lipin2 in sheep (66%) which was possibly related to the dif f erent function activities between them.

Sheep; Lpin2 gene; Cloning; Bioinformatics

S826 .2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-04-049

2016-10-19；

2017-01-11

国家自然科学基金（31372292）

焦小丽(1974-)，女，山西壶关人，博士，讲师，主要从事动物分子遗传育种研究，E-mail: jxlwjh@126.com

* 通讯作者：刘文忠，E-mail: tglwzyc@163.com