外源性硫化氢对肺移植大鼠肺血管功能改变的影响

朱宏伟 吴镜湘 徐美英

外源性硫化氢对肺移植大鼠肺血管功能改变的影响

朱宏伟 吴镜湘 徐美英

目的探讨外源性硫化氢对肺移植大鼠再灌注早期肺血管功能改变的影响。方法雄性SD大鼠随机分为对照组（假手术）、肺移植组和硫化氢－肺移植组，每组10只。硫化氢－肺移植组：于移植肺肺门开放前5 min腹腔注入外源性硫化氢（Na HS）14μmol/kg，再灌注2 h后处死大鼠，取左肺组织检测肺湿干比（W/D）、丙二醛（MDA）和髓过氧化物酶（MPO）含量以及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）。取大鼠肺动脉行离体血管环实验，分别比较血管环舒张和收缩功能功能。结果与对照组比较，肺移植组大鼠肺组织的W/D比值升高，MDA含量、MPO、iNOS活性增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与肺移植组比较，硫化氢－肺移植组大鼠肺组织的W/D比值降低，MDA含量、MPO、iNOS活性降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，肺移植组离体肺动脉对乙酰胆碱引起的内皮依赖的舒张反应降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；而使用Na HS处理后，硫化氢－肺移植组的血管舒张效应恢复到对照组水平（P＞0.05）。与对照组比较，肺移植组离体肺动脉的收缩功能下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；使用Na HS处理后硫化氢－肺移植组的血管收缩功能无明显改变（P＞0.05）。结论外源性硫化氢不仅能够减少肺移植后的氧化应激和炎症反应，抑制iNOS活性的增加，减轻缺血再灌注损伤，而且能够增强移植后离体肺血管的舒张功能。

硫化氢； 肺移植； 缺血再灌注损伤； 离体肺动脉； 一氧化氮合酶

肺移植是终末期肺疾病患者的最终治疗方法，而移植肺缺血再灌注损伤（ischemia－reperfusion injury，IRI）是导致移植肺早期功能障碍和患者死亡的重要原因［1］。新型气体信号分子H2S与多种肺部疾病相关，内源性H2S在肺组织主要由胱硫醚－γ－裂解酶（cystathionineγ－lyase，CSE）合成。近年来研究［2］表明，H2S参与了肺IRI的病理改变，且给予外源性硫化氢可不同程度地减轻肺缺血损伤。但是，H2S/CSE体系与移植肺IRI的直接关系知之甚少。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）可催化L－精氨酸生成一氧化氮（NO），NO在肺移植IRI中具有重要作用［3］。前期研究发现NO信号通路通过NO/NOS体系部分参与了移植肺损伤机制，引起肺移植缺血再灌注早期肺动脉收缩和舒张功能的损害，其机制可能与iNOS活性的异常增加有关［4］。本研究采用给予外源性硫化氢来观察对肺移植缺血再灌注早期NO/NOS通路的影响以及离体肺血管功能的变化。

材料与方法

一、动物来源和分组

雄性SD大鼠（上海中国科学院实验动物中心）300～400 g，动物生产许可证号为SCXK（沪）2007－0005，使用许可证号为SYXK（沪）2006－0033。随机分为3组，对照组（n＝10）：假手术组；肺移植组（n＝10）：肺移植后恢复再灌注2 h，平均冷缺血时间1 h；硫化氢－肺移植组（n＝10）：于移植肺肺门开放前5 min腹腔注入Na HS 14μmol/kg，再灌注2 h。

二、肺移植模型的建立

采用改良三袖套法建立大鼠左肺原位移植模型［6］，简述如下：供体鼠腹腔内注射阿托品0.2 mg和100 mg/kg氯胺酮麻醉，经胸腹U形切口进胸暴露心脏和肺，肝素化后经肺动脉，利用重力注入4℃Euro－collins溶液（Fresenius公司）20ml，灌注压20 cm H2O，于吸气末肺膨胀状态下取出心肺组织，放入盛有4℃Euro－collins溶液的容器中，显微镜下套入预先制备好的袖样套管（动脉18G、静脉16G、支气管14G）。受体手术：麻醉同前，尾动静脉穿刺置入24G套管，连接补液3 ml/h，测动脉血压，连接心电图，间断抽血0.1 ml测量动脉血气，经口行气管插管插入14G套管，潮气量10 ml/kg，呼吸频率70次/min，吸呼比为1∶2，吸入氧气分数FiO240%，左胸第4肋间进胸，10倍显微镜下解剖游离肺门后，显微心耳钳将左肺动、静脉和支气管近心端一并夹闭，嵌入橡皮泥固定。吻合时，分别在近心端绕以5－0丝线并预留外科结，远心端斜行剪一小口，顺势将供肺袖套管插入，双道结扎，妥善固定，松开钳夹在肺门近心端的心耳钳，观察血管吻合无漏血，气管吻合口无漏气后，再剪去“病肺”。开放后可见血液立即充盈移植肺，在呼吸机通气下逐渐扩张的移植肺由白色变为粉红色，调整PEEP，使其完全复张后纳入胸腔，留置胸腔引流管关闭胸腔。维持机械通气和补液，有苏醒现象则追加氯胺酮20 mg/kg，再灌注2 h后处死大鼠开胸取材。

三、离体血管制备

大鼠处死后，心肺一起取出。放入盛有4℃的混合气体（95%O2和5%CO2）饱和的Krebs液的培养皿中，显微镜下仔细分离主肺动脉和左右肺动脉分支，小心剥去外围的脂肪组织和结缔组织，舍弃袖套管上外翻的部分，然后将肺动脉剪成2～3 mm长的动脉环3段备用。血管环穿入张力测试仪的不锈钢钩，固定悬挂于盛有10 ml Krebs液的浴槽内，（37.0±0.5）℃恒温，连续用混合气体充气，连接MPA2000型多道生理记录仪（上海奥尔科特科技有限公司）记录。血管环的初始张力为1 g，并以此张力平衡45 min。每隔15 min换液一次。用终浓度0.06 mol/L（3 mol/L KCl 100μl）收缩血管环，待收缩稳定后用预热的Krebs液洗脱，反复冲洗直至张力恢复到初始值为止。

四、离体血管实验观察项目

1.离体肺动脉血管环收缩功能：采用递增浓度的去氧肾上腺素（1×10－10、3×10－10、1×10－9、3× 10－9、1×10－8、3×10－8、1×10－7、3×10－7、1× 10－6、3×10－6、1×10－5mol/L）处理血管，记录动脉环收缩的累积反应曲线。

2.离体肺动脉血管环舒张功能：先用浓度为10－7mol/L的去氧肾上腺素进行预收缩，再逐步递增乙酰胆碱的浓度（1×10－9、3×10－9、1×10－8、3× 10－8、1×10－7、3×10－7、1×10－6、3×10－6、1× 10－5、3×10－5、1×10－4mol/L）处理，记录动脉环舒张的效应累积反应曲线。

五、肺组织湿干比（W/D）测定

再灌注2 h后处死动物，取左肺组织，用锋利的刀片切取1/3，滤纸吸净表面液体，以分析天平称取湿重，再置入80℃的烤箱中，48 h后称取干重，二者之比为肺湿干比（W/D）。

六、肺组织iNOS、e NOS活性的测定

再灌注2 h后处死动物，取左肺组织0.1 g左右，使用iNOS、eNOS酶联免疫（ELISA）试剂盒（美国ADL公司），肺组织标本按1∶5（W/V）加入预冷的提取液，冰浴中匀浆，4℃下20 000×g离心60 min，在酶联板中加入样品稀释液、标准品及待测样品各100μl，37℃下120 min后弃去甩干，每孔加检测液A 100μl，60 min后弃去，洗板3次；加检测液B 100μl，37℃下60 min后弃去甩干，洗板5次；加底物溶液90μl，避光显色后加终止液50μl，在450 nm处读取OD值。

七、肺组织中丙二醛（malondialdehyde，MDA）和髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）含量测定

取左肺组织0.2 g匀浆，采用ELISA试剂盒（美国ADL公司）检测，标本处理方法与上述类似。

八、统计学处理

采用SPSS 11.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，组织标本检测部分的数据组间比较采用单因素方差分析，离体血管实验的数据采用重复测量的方差分析，两两比较采用LSD法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、肺移植大鼠离体肺血管环收缩功能的变化

去氧肾上腺素在三组中均产生浓度依赖性收缩反应，但肺移植组的血管收缩曲线明显低平（P＜0.05），提示收缩功能减弱。而使用硫化氢后肺移植组的收缩曲线没有变化，提示使用硫化氢后对肺移植大鼠离体肺血管收缩功能没有影响（图1A）。

三、三组间湿干比（W/D）比较

与对照组比较，肺移植组肺组织的W/D比增加；与肺移植组比较，使用硫化氢－肺移植组肺组织W/D比减少（P＜0.05）（表1）。四、三组间MDA、MPO、iNOS、eNOS的比较

图1 Na HS预处理对肺移植大鼠离体肺血管环去氧肾上腺素浓度反应曲线（A）和乙酰胆碱的浓度反应曲线（B）的影响。肺移植组与对照组比较，各浓度点均有统计学差异（P＜0.05）。

与对照组比较，肺移植组大鼠的MDA含量、MPO及iNOS活性均显著增加（P＜0.05），eNOS活性显著降低（P＜0.05）；与肺移植组比较，硫化氢－肺移植组大鼠的MDA含量、MPO及iNOS活性显著降低（P＜0.05），eNOS活性显著增加（P＜0.05）（表1）。

表1 三组W/D、MPO、MDA、iNOS和eNOS含量比较±s，n＝10）

表1 三组W/D、MPO、MDA、iNOS和eNOS含量比较±s，n＝10）

组别 W/D MDA（ng/ml） MPO（ng/ml） iNOS（ng/ml） eNOS（ng/ml）对照组①4.2±0.5 13.3±0.5 1.0±0.2 0.3±0.1 0.7±0.2肺移植组② 5.2±0.3 21.2±4.2 1.2±0.1 0.8±0.1 0.3±0.1硫化氢－肺移植组③ 4.6±0.3 16.3±2.1 1.1±0.1 0.5±0.1 0.5±0.1①与②比较t值 －5.42 －5.91 －2.83 －11.18 5.66P值 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05②与③比较t值 4.47 3.30 2.24 6.71 －4.47P值 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05

讨 论

肺移植后再灌注早期存在肺血管功能紊乱及微循环障碍，表现为炎细胞大量浸润，血管内皮功能失调，微循环障碍，通气－血流比值不匹配，肺水肿、急性呼吸窘迫综合征、低氧血症等，即缺血再灌注导致的肺损伤（ischemia－reperfusion－induced lung injury，IRILI），其主要环节是过度炎症反应和肺血管功能障碍［5］。有研究［6］发现，IRI时诱导型iNOS的过度升高可能参与内皮损伤机制。iNOS在生理状态下的活性很低，机体在遭受微生物内外毒素、炎性介质如肿瘤坏死因子、细胞分裂素或白细胞介素、创伤等刺激后诱导iNOS表达，发挥细胞毒性作用，加重组织的损伤［7－8］。MDA是氧自由基使细胞膜中多价不饱和脂肪酸发生过氧化反应的终产物，代表了膜脂质过氧化的程度，又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。MPO是中性粒细胞所特有，其活性与组织中多形核粒细胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）浸润程度成正比，被认为是多形核粒细胞浸润的可靠指标。肺湿干比重（W/D）反映了肺水潴留的情况，可以反映肺功能损害的程度。肺水潴留是肺缺血导致肺毛细血管通透性增加和肺泡毛细血管膜破坏的直接后果。

在肺缺血再灌注的反应中，NO是很重要的参与者［9］。肺血管内皮细胞合成eNOS生成的NO可舒张肺血管［10］，降低肺血管阻力、抑制白细胞和血小板渗出的作用，而iNOS能催化合成大量非生理浓度的NO，与氧自由基反应，产生半衰期更长、细胞毒性更甚的超氧亚硝酸阴离子ONOO－而起毒性作用［11］。另外，过量NO可介导细胞毒性和促进肺泡细胞凋亡，从而引起肺损伤［12］

本实验中我们发现，与对照组相比，肺移植组缺血再灌注2 h后MDA含量、MPO和iNOS活性明显增加；肺移植组的肺湿干比重（W/D）明显增加。这表明在肺IRI过程中发生的氧化应激和炎症反应，一方面造成了肺微循环障碍，微血管通透性增高；另一方面可诱导不依赖钙离子的iNOS在转录水平激活。应用外源性硫化氢后MDA含量、MPO和iNOS活性明显降低，肺移植组的肺湿干比重（W/D）明显减少，氧化应激和炎症反应减轻，微血管通透性改善，减轻移植后肺IRI。

离体血管实验的结果显示，在对照组中乙酰胆碱能明显松弛由去氧肾上腺素预收缩的离体肺动脉，而对于肺移植缺血再灌注2 h后的离体肺动脉，乙酰胆碱的舒张效应明显减弱。这表明，eNOS源性的NO的产生被认为有助于维持基础条件下肺微血管低张力［13］。而血管壁中的iNOS活性呈病理性增强，抑制eNOS活性，降低NO的生物利用度，使内皮依赖的乙酰胆碱舒血管反应受损。而给予硫化氢处理的肺移植组的离体肺动脉对乙酰胆碱的舒张效应恢复到了对照组水平，说明硫化氢对肺移植后肺血管有舒张作用，这种舒张作用可能与硫化氢本身的舒血管作用有关［14］；另外可能抑制了iNOS活性的异常增高，减轻炎症反应，使eNOS活性增加，NO的生物利用度增强，血管舒张作用进一步增强。

与对照组相比，肺移植组的离体肺动脉对去氧肾上腺素的收缩反应减弱。这可能是由于缺血再灌注早期iNOS活性的异常增强可以与超氧阴离子反应，形成硝基超氧化物，同时在形成硝基过氧化物时竞争结合一部分超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），将不利于氧自由基的清除，并且形成的较高水平的硝基过氧化物可向组织扩散，与相应的组织蛋白和脂质结合形成脂质过氧化物，降低NO的生物利用度。这些氧化应激和炎症反应损伤的产物使血管对α－肾上腺素受体激动剂的反应敏感性减弱，收缩反应降低［15］；使用硫化氢后氧化应激和炎症反应降低，iNOS活性降低，收缩反应有所提高，但是由于舒张作用增加，抵消了收缩作用，因此使用硫化氢后移植肺的肺动脉收缩作用无明显改善。

总之，本研究发现应用外源性硫化氢不仅能够减少肺移植后的氧化应激和炎症反应，抑制iNOS活性的增加，减轻IRI，而且能够增强移植后离体肺血管的舒张功能。

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Effects of hydrogen sulfide on function change of isolated pulmonary artery in rat lung transplantation model

ZhuHongwei，WuJingxiang，XuMeiying.DepartmentofAnesthesiology，ShanghaiChest Hospital，ShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200030，China

：XuMeiying.Email：xumeiyingxk＠163.com

ObjectiveTo investigate the effects of hydrogen sulfide on function change of isolated pulmonary artery in rat lung transplantation model.MethodsMale SD rats were randomly divided into control group（sham operation group），lung transplantation group and lung transplantation＋hydrogen sulfide group，with 10 rats in each group.In hydrogen sulfide＋lung transplantation group，orthotopic left lung allograft transplantation was performed，and hydrogen sulfide 14μmol/kg was injected intraperitoneally at the beginning of reperfusion.Rats were sacrificed 2 h after reperfusion，and left lung tissues were harvested to determine the wet dry ratio（W/D），content of malondialdehyde（MDA）and activity of myeloperoxidase（MPO）and inducible nitric oxide synthase（iNOS）.Isolated pulmonary artery rings were prepared，and the vasodilation and contraction function of pulmonary artery rings were compared.ResultsThe W/D，MDA content and activity of MPO and iNOS in lung transplantation group were significantly higher than those in control group（P＜0.05）.The W/D，MDA content and activity of MPO and iNOS in lung transplantation＋hydrogen sulfide group were significantly lower than those in lung transplantation group（P＜0.05）.Compared with control group，the endotheliumdependent vasodilation function of isolated pulmonary artery significantly decreased in lung transplantation group（P＜0.05），but after hydrogen sulfide treatment，the vasodilation functionrestored to the level in control group（P＞0.05）.The contraction function of isolated pulmonary artery in lung transplantation group was significantly lower than that in control group（P＜0.05），but there was no significant change in contraction function of isolated pulmonary artery in lung transplantation＋hydrogen sulfide group（P＞0.05）.ConclusionsHydrogen sulfide can alleviate the oxidative stress and inflammatory reaction，inhibit the activity of iNOS，reduce the ischemia－reperfusion injury after lung transplantation，and improve the vasodilation function of isolated pulmonary artery after transplantation.

Hydrogen sulfide； Lung transplantation； Ischemia－reperfusion injury； isolated pulmonary artery； nitric oxide synthase

2016－10－10）

（本文编辑：周珠凤）

10.3877/cma.j.issn.2095－8773.2017.01.05

上海市卫生局科研项目（20124331）

200030 上海交通大学附属胸科医院麻醉科

徐美英，Email：xumeiyingxk＠163.com

朱宏伟，吴镜湘，徐美英.外源性硫化氢对肺移植大鼠肺血管功能改变的影响［J/CD］.中华胸部外科电子杂志，2017，4（1）：22－26.