α-淀粉酶的研究与应用进展

李文钊，臧传刚，李义，陶进，潘忠，许克家，梁颖超，佟毅＊

（1. 吉林中粮生化有限公司（玉米深加工国家工程研究中心），吉林 长春 130033; 2. 中粮营养健康研究院，北京 昌平 102209）

α-淀粉酶的研究与应用进展

李文钊1,2，臧传刚2，李义1，陶进1，潘忠2，许克家2，梁颖超1，佟毅1＊

（1. 吉林中粮生化有限公司（玉米深加工国家工程研究中心），吉林 长春 130033; 2. 中粮营养健康研究院，北京 昌平 102209）

α-淀粉酶是一种重要的淀粉水解酶，它能够切断淀粉内部的糖苷键，产生糊精、低聚糖和葡萄糖等。α-淀粉酶可以从植物、动物或微生物中获得，但工业应用中的α-淀粉酶绝大多数来自细菌和真菌。不同来源的淀粉酶活力和热稳定性有很大差异，其中嗜热淀粉酶在实际应用中非常重要和广泛。α-淀粉酶的制备工艺可以采用深层发酵或固态发酵的方法。目前α-淀粉酶已广泛应用于食品、纺织、造纸、洗涤剂工业，用于生产麦芽糊精，淀粉改性，葡萄糖、果糖的制备，燃料乙醇的生产等等。主要阐释α-淀粉酶的性质、制备、纯化、表征以及在工业中的应用。

α-淀粉酶；微生物法制备；热稳定性；应用

淀粉是人们膳食结构中最重要的组成部分，主要来源有玉米、小麦、大米、马铃薯和木薯等。淀粉除了可以直接加工成各种食品，还可作为原料，利用化学法或酶法来水解，从而获得葡萄糖、果糖、麦芽糖糊精及衍生物等产品。淀粉水解后产生的葡萄糖还可以继续发酵用于生产乙醇以及制备其他衍生物[1,2]。淀粉包含直链淀粉和支链淀粉，不同来源的淀粉中直链淀粉和支链淀粉的含量不相同，一般来讲，直链淀粉约占淀粉的20%～25%，它是由葡萄糖单元通过α-1，4-糖苷键结合而成的线性聚合物，溶于热水但不成糊状，遇碘变蓝。支链淀粉占淀粉的 75%～80%，葡萄糖单元除了通过α-1,4-糖苷键线性连接，平均每15-45个葡萄糖单位会有分支出现，分支以α-1,6-糖苷键连接，支链淀粉与热水作用会膨胀成糊状，遇碘呈紫或紫红色。随着工艺的提高和新型淀粉酶的开发利用，酸法等传统淀粉水解工艺已慢慢淘汰，而广泛采取更高效、温和的酶法生产葡萄糖及果糖等产品。

1 α-淀粉酶的作用

α-淀粉酶（1,4-α-D-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1）是一种工业中重要的淀粉水解酶，广泛应用于食品、酿造、制药和纺织等工业领域，比如用于淀粉液化、纺织物脱浆、造纸工业中的淀粉改性，以及用于酿造、烘焙和洗涤剂等。其中用于淀粉转化领域的酶制剂销量占全世界酶制剂销售总量的10%～15%[3]。α-淀粉酶能切割淀粉、糖原或多糖的内部α-1,4糖苷键，产生短链糊精、寡糖、葡萄糖和麦芽糖等产物，该过程使淀粉黏度迅速降低，在工业应用中也称α-淀粉酶为“液化酶”。α-淀粉酶是一种金属酶，不同来源的酶含有1个到10个不等的Ca2+，Ca2+对α-淀粉酶维持活力和热稳定性有重要作用[4]。最早使用的商品化α-淀粉酶来自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的α-淀粉酶，称作Termamy1，Termamy1和很多高效的α-淀粉酶的活性都需 Ca2+使蛋白保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定性。除了 Ca2+外，其他的离子比如Mg2+、Na+、Cl-等对α-淀粉酶的结构和功能也有重要作用，比如芽孢杆菌菌株 KSM-K38产生的淀粉酶就是靠Na+来保持其结构和功能[5]。水解酶有内切水解酶和外切水解酶2种类型，内切水解酶作用于底物分子内部，而外切水解酶作用于非还原末端[6]，α端的葡萄糖残基以及α-1,6-糖苷键不能被α-淀粉酶水解。一般α-淀粉酶在pH=5.5～8.0时酶活性较稳定，当然也有例外，比如黑曲酶生产的α-淀粉酶最适合的pH值为4。

2 α-淀粉酶的来源

α-淀粉酶可以从植物、动物或微生物中分离提取得到。不同来源的α-淀粉酶功能相似，但在最适温度、pH等应用条件上有差异，比如从木薯粉碎后的废液中分离的α-淀粉酶较其他淀粉酶适用的 pH和温度范围都很广[7]。

目前，α-淀粉酶在商品化制备方面基本都是通过微生物法进行的，这主要有两个方面原因：一是微生物的生长速度快，酶的生产速度也快，与动物和植物相比微生物更易于操作，微生物培养需要的空间低，投入产出比更高；二是淀粉酶生产菌株可以通过基因工程、诱变、驯化等方式提高酶的生产效率，提高热稳定性，改良品质等，这对扩展淀粉酶的应用范围和提高其效率有重要作用。提高热稳定性是α-淀粉酶菌株筛选的重要工作，一是使菌株更适应工业应用的条件，减少能耗并缩短反应时间；二是当淀粉在较高温度下进行水解时，D-葡萄糖与异麦芽糖的聚合最小，这样有利于提高目标产物的得率。

制备商品化的α-淀粉酶的微生物可以是细菌，真菌或基因工程菌等。细菌来源的、使用最广泛的是来自芽孢杆菌属（Bacillus spp.）的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）。其他的也具有产α-淀粉酶能力的菌株有蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等。地衣芽孢杆菌（B.licheniformis），嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus.stearothermophilus）和解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）产生的α-淀粉酶在食品、发酵、纺织和造纸等工业中应用最为广泛[8]。

热稳定性对α-淀粉酶的工业应用至关重要，比如在目前的淀粉糖工业制备中，淀粉喷射液化是在高温（105～118 ℃）条件下进行的，提高酶的热稳定性一方面可以提高液化温度，使淀粉液化效果更好，另一方面可以提高产品得率、获得高附加值产品如葡萄糖、结晶葡萄糖、葡萄糖浆、麦芽糖和麦芽糖糊精等。研究表明，枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、嗜热脂肪芽孢杆菌（B. stearothermophilus）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）和解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）能产生耐热性能比较好的α-淀粉酶。另外，一些嗜盐微生物产生的酶能够耐受高盐浓度，这类酶可应用于许多使用浓盐溶液的苛刻的工业过程，而一般的淀粉酶在这些条件下活性会受到严重抑制。此外，大多数卤代细菌产生的酶对高温具有相当的耐受性，并且可以在长时间内在室温下保持稳定。研究表明，来自嗜盐细菌如嗜铬杆菌（Chromohalobacter spp.），卤杆菌属（Halobacillus spp.），盐单胞菌属（Haloarcula hispanica，Halomonas meridiana）的微生物能生产较好的嗜酸性淀粉酶[9]。

真菌来源的α-淀粉酶主要来自曲霉属及少数青霉菌属。近年来，利用青霉菌（Penicillium fellutanum）深层发酵已被广泛用于生产α-淀粉酶，青霉菌MT-1（Penicillium expansum MT-1）固态发酵也被用于通过生产α-淀粉酶[10]。淀粉酶固态发酵生产一般使用黄青霉（Penicillium chrysogenum）作为菌株，底物使用玉米芯叶，小麦秸秆和麦麸等[11]。其他的用于生产商品化α-淀粉酶的真菌来源的菌株主要是曲霉属菌株，比如米曲霉（Aspergillus oryzae），黑曲霉（Aspergillus niger），泡盛曲霉（Aspergillus awamori）和烟曲霉（Aspergillus fumigatus）等。烟曲霉已经广泛用于通过深层发酵技术生产酶[12]。

基因工程菌株也被广泛用于生产α-淀粉酶。研究人员通过对解淀粉芽孢杆菌 UNG-16（B.amyloliquefaciens UNG-16）利用化学诱变剂甲基磺酸乙酰（EMS）以及物理辐射方法进行突变，筛选获得一株表型较好的突变株，表现出 102.78±2.22 U/ml/min的活性，比亲本菌株高出1.4倍[13]。用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍处理枯草芽孢杆菌马尔堡（B. subtilis Marburg），突变株与亲本菌株相比，其中一个突变体YN9的酶的产量增加了三倍[14]。

3 α-淀粉酶的制备

生产商品化α-淀粉酶的大规模发酵制备方法基本分为两种：深层发酵(Submerged Fermentation，SmF）和固态发酵（Solid State Fermentation，SSF）。深层发酵是α-淀粉酶生产的传统方法，一般采用糖蜜和肉汤等作为碳源和氮源，发酵产生的次级代谢产物可以直接分泌到发酵液中，但这种方法底物消耗较快，需要在发酵过程中不断进行流加补充，比较适用于对水分要求较高的微生物菌种[15]。深层发酵方法物料的灭菌和最终产品的纯化过程更容易，对温度、pH值、通气量、溶氧和水分等过程参数的控制和优化也比较方便。固态发酵则是适用于生长过程中对水分要求较低的微生物发酵，在该方法中通常使用的固体底物是麸、甘蔗渣和纸浆等。这种方法的最大优点是富含营养物质的废料可以被再度利用。在固态发酵技术中，底物稳定缓慢的消耗，可以利用较长时间，因此在生产工艺上不需要考虑底物持续供给[16]。固态发酵的另一个优点是对设备要求简单，生产效率更高，产品浓度更高，污水产生较少。由于以上几个原因，固态发酵被认为是用于商业生产酶的最有潜力的方法。

4 酶活检测

α-淀粉酶的酶活检测方法有很多种，一种方法是原理是通过测定其与淀粉作用后释放的还原糖量来确定，如DNS法、Nelson-Somogyi (NS)法；另一种方法是通过测定淀粉的消耗，即通过测量淀粉-碘络合物的吸光度来确定水解程度，如碘法。

4.1 DNS法

这种方法利用二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该反应产物在高温条件下显现棕红色，且在一定浓度范围内其颜色深浅与还原糖含量成正比，可以用比色法测定还原糖含量。具体实验操作是，将底物溶液与酶溶液等量混合，随后50 ℃热育10 min，向试管中加入DNS试剂，将混合物置于沸水浴5 min。冷却至室温后，测定上清液540 nm处的吸光值。在对来自芽孢杆菌菌株 GM8901的嗜碱性α-淀粉酶的研究中，通过 DNS方法测定还原糖进行酶活检测，孵育后发现其活性最高为0.75 U/mL[17]。

4.2 Nelson-Somogyi (NS)法

NS法也是一种利用显色反应测定还原糖的方法。具体操作过程是，先将底物溶液均分，在50 ℃下加热5 min。将预热（50 ℃，5 min）的酶溶液加入到底物中，该反应混合物在50 ℃下进行10 min，后加入CuSO4试剂终止反应。然后将其在沸水浴中孵育40 min并冷却至室温。接着加入钼酸盐试剂，并在室温下孵育10 min。最后加入水，混合物以13 000 r/min离心1 min，测定上清液610 nm处的吸光度[18]。从古细菌天竺葵属菌株 Ah-36（Natronococcus sp. Strain Ah-36）分离的嗜碱性α-淀粉酶用NS法测定酶活，在孵育35小时结束时酶活为0.01 U/mL， 90 h后最大活性为0.12 U/mL，110 h后仍保持最大活性[19]。

4.3 碘法

直链淀粉和支链淀粉遇碘显色不同。α-淀粉酶的水解活性液可以用直链淀粉和碘反应形成蓝色络合物的方法来确定。支链淀粉遇碘呈现紫红色。在直链淀粉聚合度降低到一定程度时，其与碘的复合物呈红棕色。

在酶底物反应终止后，可以通过测定其吸光度确定α-淀粉酶水解淀粉的程度。在对嗜热α-淀粉酶表征的研究中，粗酶样品在 92 ℃下与可溶性淀粉一起热育10 min，在冰水中冷却反应混合物终止反应，在反应混合物中添加碘与淀粉形成有色复合物，用水稀释后，使颜色达到可以在600 nm读取的可测量的范围[20]，通过此操作可以准确测量酶活。

5 α-淀粉酶的纯化和表征

为了节约生产成本，工业应用的酶制剂较少进行下游处理，通常使用的是粗制品。而在临床和制药行业，以及当用于研究结构功能关系和生物化学性质时，酶必须进行高度纯化。酶蛋白的纯化，通常使用的方法是沉淀，色谱分离，萃取，具体使用那种方法取决于需要纯化的酶的性质，要实现高纯度酶的制备一般会采用上述方法的组合，纯化所涉及的步骤数将取决于所需的纯度程度[21,22]。如果是胞外分泌的酶，可以通过过滤和离心的方法获得；如果是胞内酶，可以通过加入生玉米淀粉，然后过滤分离。粗淀粉酶一般先用硫酸铵或有机溶剂进行沉淀，沉淀后的样品可以用水或缓冲液进行透析进一步浓缩，接着可以使用色谱技术，如离子交换、凝胶过滤和亲和层析等进一步分离和纯化酶。

在一个黄曲霉（Aspergillus falvus var.）生产的酶的研究中，研究人员首先是将蛋白沉淀，然后进行透析，然后用柱色谱法获得了较纯的蛋白[23]。在另外一项研究中，研究人员首先使用三氯乙酸（TCA）和丙酮沉淀蛋白样品，再用凝胶过滤柱过滤，过滤液进一步利用离子交换柱纯化，最终获得较高纯化的蛋白样品[24]。在对来自产气荚膜梭菌A（Clostridium perfringens Type A）的细胞外α-淀粉酶的纯化和表征的研究中，是通过聚乙二醇沉淀，先制备粗酶浓缩物，然后将该浓缩样品通过色谱柱分离，可以看到有三个不同的淀粉分解的峰，然后分别收集来自单峰的组分，并继续进行色谱分离，然后在Sephacryl S-100 HR柱上分离获得高纯度蛋白[25]。纯化由海栖热袍菌 MSB（Thermotoga maritima MSB8）产生的α-淀粉酶，破碎后的沉淀用阴离子交换层析蛋白，接着用蛋白电泳鉴定下纯度，最后再经过一些列色谱柱等进行纯化[26]。

酶在完成表达和纯化后需要进一步表征和鉴定，最常用的，也是最快速和直接的是通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的方法来表征。蛋白加热后会变性，使用染色剂（如考马斯亮蓝或硝酸银）对蛋白进行染色，然后在凝胶上把分子标签蛋白和样本同时电泳，通过比对可以判断目的蛋白的分子量，也可判定所得酶的纯度和均一性[27]。例如，由牛链球菌148（Streptococcus bovis 148）表达的胞内α-淀粉酶，分离纯化后，其电泳凝胶上出现单条带，这表明分离纯化步骤的效果很好，而且通过与标签比较可以确定纯化后的分子量，从而确定细胞内的α-淀粉酶以单体形式存在[28]。

6 α-淀粉酶的工业应用

α-淀粉酶由于其在淀粉水解上优良的性能，在工业的很多领域有诸多应用。使用淀粉酶对环境的污染少，工艺操作更简单，已经取代了很多工业产品制造中的常使用的化学水解方法。现将α-淀粉酶的工业应用总结如下：

6.1 果葡糖浆生产

α-淀粉酶广泛用于水解淀粉转化成为其他高附加值的产品，如用于生产果糖以及果葡糖浆。果葡糖浆的生产过程一般包括以下几个步骤：淀粉液化、糖化和葡萄糖异构化。在工业生产中，首先是调浆，使淀粉颗粒溶解在水中形成粘性淀粉悬浮液，接着通过α-淀粉酶部分水解淀粉形成短链糊精，降低淀粉悬浮液粘度使淀粉液化。糖化是进一步水解淀粉生产葡萄糖，利用糖化酶从非还原末端切割α-1,4糖苷键，产生高葡萄糖浆。然后通过葡萄糖异构酶催化的异构化将该高糖浆转化为高果糖糖浆。所获得的葡萄糖和果糖混合的果葡糖浆用作甜味剂，广泛用于食品领域特别是在饮料工业中[21,29]。

6.2 烘焙业

在面包烘烤过程中将α-淀粉酶加入到面团中，可以使淀粉水解成可供进一步由酵母发酵的小糊精，这能提高了发酵速率。此外，淀粉水解降低了面团的粘度，改善了面团质地，增加了面包体积。

淀粉产品烘烤后，进行长期储存可能会发生一些变化，其中有些不好的变化，如酥皮坚硬度增加，外壳脆度下降，面包屑含水量下降和面包风味丧失等称为陈化。α-淀粉酶可用作处理这种情况的抗陈化剂，以提高烘焙食品的保质期和柔软度。

虽然α-淀粉酶具有降低粘性的作用，但过量可能会导致面包的粘性增加，是由于分支糊精导致的。在这种情况下，支链淀粉酶与淀粉酶组合使用，可以使淀粉酶处理过的面包的粘性的化合物的特异性水解[30]。

6.3 洗涤剂业

随着餐具洗涤和洗衣方式的改进，洗涤剂中酶的使用越来越普遍，使用量也持续增加。早期洗涤剂中普遍添加的是化学物质，对人体可能有害，且对金属和木质餐具也会造成损害，使得洗碗条件变得苛刻。相比较而言，不论对环境还是对人体，酶使用起来更安全，且酶的使用条件更温和，适合常温条件下的使用，这更符合人们使用的习惯，使得酶制剂在洗涤剂中得到了广泛开发和应用。

对于衣服污渍而言，很多淀粉加工类食物残留，如糕点等，粘在衣服上的淀粉污物还能吸附灰层、土壤颗粒使衣服更易脏。α-淀粉酶可以将含淀粉的食物颗粒消化成较小的水溶性寡糖，用水冲洗后达到去除污渍的目的。此外，α-淀粉酶在低温和碱性pH下的稳定性很高，有助于其在洗涤剂开发中适应更广泛应用条件。

目前90%的液体除垢剂中都含有α-淀粉酶，且自动洗碗机的除垢剂对α-淀粉酶的需求也在不断增长。使用α-淀粉酶的缺点是淀粉酶的对金属离子的依赖如Ca2+，在低Ca2+环境下稳定性可能较差，此外α-淀粉酶还对氧化剂敏感，这些缺点可以通过使用基因改造菌株产生的α-淀粉酶克服，著名的酶制剂公司诺维信和杰能科是两家主要的α-淀粉酶供应商，他们已经通过基因工程改良了淀粉酶的品质，比如他们对地衣芽孢杆菌淀粉酶进行了改造，将197位易被氧化的蛋氨酸突变成亮氨酸，使得淀粉酶对氧化化合物具有更好的耐受性[21]。

6.4 纺织业

在纺织工业中，纤维在制造和编织过程中受到机械处理常常导致经纱断裂。为了加强螺纹，需要提前在纱线的表面加一层上浆剂，并且在织物编织完成之后去除。可以充当保护层的材料其实有很多种，淀粉是最优良的上浆剂，首先它非常容易获得，其次其价格便宜并且可以很容易从织物中去除。在应用中，在脱浆过程中先利用α-淀粉酶水解淀粉层，将淀粉颗粒降解成易溶于水的糊精，糊精很容易被清洗掉。因淀粉酶只作用于淀粉分子，而不作用于纱线纤维，纺织品的质量不受影响[21]。

6.5 造纸业

在造纸行业中，淀粉通常被用作施胶剂，用于纸张表层处理。天然淀粉粘稠性较高，不适合直接在纸上涂布，一般使用α-淀粉酶先使淀粉部分水解，使其粘度降低，这有利于纸张上浆。α-淀粉酶处理过的淀粉在造纸中的作用有两方面：一方面防止纸张在加工过程中受到机械损伤，另一方面也有利于改良纸张在强度、光滑度、书写和擦除等方面的质量[31]。

6.6 燃料乙醇

在燃料乙醇的生产中，首先将原料处理获得淀粉，原料可以是玉米、木薯、水稻等。接着将淀粉进行液化以形成粘性淀粉悬浮液，在这个过程中，α-淀粉酶主要用于淀粉液化水解，之后是糖化过程，在复合糖化酶的作用下产生葡萄糖，然后这些葡萄糖作为酿酒酵母的底物，经过发酵后产生酒精。在近年来菌株改造的前沿研究中，科研人员把能进行淀粉分解酵母扣囊复膜酵母（Saccharomyces fibuligera）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）进行原生质体融合，经过大量筛选，最终获得可以直接从淀粉生产乙醇的新酵母菌株，这减少淀粉糖化步骤，是一个非常具有潜力的技术[32]。

7 总 结

随着社会进步，环境保护标准的提高，以及可持续发展理念的重视，生物酶的应用更加广泛。α-淀粉酶在以淀粉为原材料的工业中将持续发挥重要作用，包括淀粉深加工行业、洗涤剂业、纺织业、烘焙食品以及生物燃料等。通过菌株筛选或基因工程改造获得热稳定性更好、生产性能更高的淀粉酶生产菌株仍然是基础和重要的工作，提升蛋白纯化技术将有利于将淀粉酶应用拓展到药物和临床领域。生产成本的降低和应用领域的拓展，将使α-淀粉酶发挥更大作用。

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Research and Application Progress of α-Amylase

LI Wen-zhao1,2, ZANG Chuan-gang2, LI Yi1, TAO Jin1, PAN Zhong2, XV Ke-jia2, LIANG Ying-chao1, TONG Yi1*
（1. Jilin COFCO Biochemical Co., Ltd. , National Engineering Research Center of Corn Deep Processing, Jilin Changchun 130033,China； 2. COFCO Nutrition and Health Institute, Beijing 102209, China）

α-Amylase is a hydrolase enzyme that can catalyse the hydrolysis of internal glycosidic linkages in starch to yield products like dextrins, oligosaccharides or glucose. α-Amylase can be isolated from plants, animals or microorganisms, but α-amylase for commercial application is mainly derived from bacteria or fungi. Thermostability is a desired characteristic for amylase in application, the activity and thermostability of α-amylase from different sources are different. There are mainly two ways for production of α-amylase on commercial scale: submerged fermentation and solid state fermentation. Nowadays, α-amylase has been widely used in the production of maltodextrin, glucose,fructose, starch modification, bakery industry, desizing of textiles, paper industry, detergent industry, fuel ethanol production and so on. In this paper, properties, production methods, purification methods, characterization of α-amylase were introduced as well as its applications.

α-amylase; Microbial production; Thermostability;Application

TQ925+.1

A

1671-0460（2017）11-2292-05

吉林省科技攻关计划重大科技招标专项，项目号：20150203005NY。

2017-07-11

李文钊（1984-），男，理学博士，2013年毕业于吉林大学，研究方向：生物物理学。E-mail：liwenzhao@cofco.com。

佟毅（1963-），男，博士，教授级高工，研究方向：玉米深加工。E-mail:tongyi@cofco.com。