量子点作为荧光探针的生物应用进展

郭欣欣 尔夏提·图尔荪 韩振玉 李金珠 杨焱 刘天才

•综 述•

量子点作为荧光探针的生物应用进展

郭欣欣 尔夏提·图尔荪 韩振玉 李金珠 杨焱 刘天才★

量子点作为一种新型的荧光纳米材料，因其量子效应，宽激发光谱及高摩尔消光系数等优点引起了广泛关注，近年来，随着水溶性量子点制备技术的发展，其生物学应用也愈发广泛。本文简述量子点的结构和特性，及水溶性量子点作为荧光探针在生物成像、体外诊断及其他方面的生物学应用，对磁珠量子点在体外诊断的应用、量子点在快速诊断中的应用、量子点的双标记、量子点在光激化学发光法的初步应用作重点论述。另外本文还对其应用的高通量、自动化、多元化作一展望。

量子点；生物学应用；荧光探针；体外诊断

量子点（quantum dots，QDs）是一种半导体材料，具有独特的荧光发光特性。Chan等［1］将量子点进行表面功能化应用到细胞成像领域，拉开了量子点在生物学领域应用的序幕。标记免疫学，就是将标记技术和免疫学结合进行分析检测的一门学科，其原理是利用抗原抗体高特异性来检测体内生物活性物质的活性或浓度。随着水溶性量子点制备技术的改进，其作为探针越来越广泛的应用于生物学医学领域特别是免疫学检测。本文就量子点在生物学领域特别是体外诊断方面的应用作一综述，并对其未来发展趋势进行展望。

1 量子点的结构及特性

半导体量子点是一种由几个原子组成的三维团簇半导体材料，每个维度尺寸均在纳米级，是介于分子和晶体之间的过渡态。目前报道的主要是由Ⅱ⁃Ⅵ族（如 MgS、CdSe、ZnTe、HgSe）和 Ⅲ⁃Ⅴ族（如 GaAs、InGaAs、InP、InAs）元素组成的均一或核壳结构（如CdSe/HgS）纳米颗粒。自上世纪70年代被首次发现后，就吸引了物理学家、电子工程学家以及化学家的注意。随着量子点制备技术的提高，其在生物医学研究中也呈现极大的应用前景［2⁃5］。与有机荧光染料相比，量子点具有很多优势，如量子效应、激发光谱宽、发射光谱窄、摩尔消光系数高、抗光漂白性强、不易化学降解、荧光寿命长、发射光的颜色随粒径变化等等，这些光学特性使之可以通过改变激发波长来减少激发光与荧光信号之间的干扰，实现多元分析［6⁃8］。量子点所具有的上述优势，在体外诊断、活细胞成像等领域具有广泛的应用价值。

2 生物学领域的应用

2.1 量子点在体外诊断的应用

2.1.1 量子点⁃磁珠在体外诊断的应用

磁珠，即磁性纳米颗粒，是上世纪50年代研发的一种新型功能材料，主要由铁、钴、镍等过渡金属的氧化物构成，在外加磁场的作用下，磁珠可以快速的与液相分离，具有操作简便、分离效率高、较大的比表面积及良好的物理稳定性等优点［9⁃10］。目前，将磁珠高效分离和富集作用与免疫学反应结合，成为近年来发展起来的一项新的免疫学技术⁃免疫磁珠，并在免疫检测、蛋白纯化等领域得到越来越广泛的应用。

Zhu等［11］借助磁珠和量子点，以双抗体夹心模式检测人C反应蛋白（C⁃reactive protein，CRP），磁珠端与抗CRP的单克隆抗体连接，链霉亲和素化的QDs与生物素化的另一配对的单克隆抗体连接，形成免疫复合体，用于捕获血清中游离的CRP。通过检测QDs的荧光信号，来检测血清中CPR浓度。该法CRP最低检测极限为0.5 fmol/L，检出范围在0.01 nmol/L～7 nmol/L。

Sun等［12］利用磁珠为载体，量子点（QDs）为示踪物，用于检测生物样本中的汞离子残留。利用BSA⁃DTPA⁃Hg复合物作为完全抗原免疫BALB/c小鼠得到一株单克隆抗体Hg⁃mAb。该单克隆抗体与磁珠连接，链霉亲和素化的QDs与生物素化的BSA⁃IgG结合，构成双抗体模式，来检测生物样品中残留的汞离子。该方法Hg2＋检出范围在1～1000 ng/mL，检出时间缩短至30 min，有望用于人体内Hg2+的快速检测。

2.1.2 量子点在免疫层析快速诊断中的应用

快速诊断，又称之为即时诊断（point⁃of⁃care testing，POCT），是指在病人旁边进行的临床检测，在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时的复杂程序，快速得到检验结果同时也为患者争取了抢救时间的一类诊断方法［13⁃14］。Yang等［15］的研究中利用免疫层析法（immunochromatog⁃raphy，ICTS）来快速检测人血清中的甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）。该团队基于双抗体夹心模式，用荧光稳定的量子点标记检测抗体，其配对的包被抗体固定在免疫层析试纸条的检测线（T line），用自制的荧光检测仪来检测其荧光强度。该法最低AFP检出量为1 ng/mL，且样品量少，仅需50 μL，整个过程只需10 min，大大减少其检测时间。这种方法所需样品量少、时间极短，对于其他的肿瘤标志物也具有极好的应用前景。

众所周知，中国是肝炎大国，而乙型肝炎病毒表面抗原是肝硬化、肝癌的主要诱因，低丰度蛋白人乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等的早期检测具有非常重要的意义。Shen等［16］利用免疫层析法，将量子点作为信号放大探针，基于夹心模式，检测人血清中的HBsAg。他们用Ren报道的方法制备了量子点QDs并与抗HBsAg的单克隆抗体连接，作为量子点探针 QD⁃mAb［17］。免疫层析试纸条上检测线（T线）上包被羊抗HBsAg的多克隆抗体G⁃pAbs，控制线（C线）上包被驴抗鼠的多克隆抗体D⁃pAbs。人阳性血清样本事先与量子点探针混匀，形成量子点探针⁃表面抗原复合物即QD⁃mAb⁃HBsAg复合物，该复合物可以被试纸条上的T线及C线包被的抗体捕获，2条线均可形成荧光信号；当人血清样本为阴性时，QD探针无法与G⁃pAbs形成夹心模式，此时仅C线有荧光信号。该法的检测范围在75 pg/mL～75 ng/mL，远比传统的胶体金免疫层析法检测范围宽；所需样本量仅70 μL，检测时间缩短在15 min以内，这也大大减轻患者创伤；在49名阴性样本中测得假阳性率为0。鉴于以上优势，该法也有望用于其他疾病的蛋白标志物的检测。

2.1.3 量子点的双标记免疫分析

鸟类流感病毒是高致病性的流感病毒，造成国内家禽的严重疾病甚至死亡，引发人类感染甚至死亡。鸟类A型病毒又可分为很多亚型，其中H5、H9亚型为常见的引起人类严重呼吸系统疾病。Wu等［18］以此为出发点，结合水溶性量子点表面的氨基与相对应亚型鼠源单克隆抗体上的羧基连接作为荧光探针，亚型H5和H9相对应的包被抗体分别对应检测线1和检测线2，包被的羊抗鼠IgG作为控制线，当样本中存在2种亚型病毒时，则3条带均有荧光；当只存在亚型H5时，则测试线1和控制线有荧光；只存在亚型H9时，测试线2和控制线有荧光；2种都不存在时，只有控制线有荧光。该方法快速简便又灵敏，其H5和H9的检测极限值为0.016 HAU和0.25 HAU（hemaggluti⁃nating units）。该法把检测时间控制在15 min以内，且检测极限值低，可以用于病毒的早期诊断，从而有效的预防并阻止病毒的扩散。

2.1.4 量子点在光激化学发光法中的初步应用

光激化学发光法（luminescent oxygen channel⁃ing assay，LOCI）始于上世纪90年代，是一种均相的免疫分析技术，与传统的非均相免疫分析技术相比，具有灵敏度高、时间分辨能力强、线性范围宽、免洗板、快速简便等优点。该法原理是，反应体系中包括供体微球和受体微球，当2个微球距离小于200 nm时，在680 nm的激发光照射下，供体微球会释放单线态氧，单线态氧将能量传递给受体微球上的酞氰化合物，从而发出荧光［19］。Zhuang等［20］利用LOCI这些特性，用溶胀法将量子点包裹在受体微球内，这样接收了能量的酞氰化合物可以再一次将能量传递给量子点，双重的能量传递可以检测到更高的荧光值。这也是首次将LOCI与量子点相结合的报导，这项方法的建立也为未来量子点的应用提供了新的思路。

2.2 量子点的生物成像

2.2.1 量子点的细胞成像

目前，监控生物分子的反应过程的方法很多，其中一种重要的方法是将细胞或组织固定后用荧光探针对靶分子进行标记成像。1998年，Chan等［1］将用巯基丙酸修饰的水溶性量子点首次用于Hela细胞成像，拉开了量子点在生物成像这一领域应用的序幕。董薇等［21］用谷胱甘肽（glutathi⁃one，GSH）作为稳定剂，在水相中合成了能稳定发射橙色荧光和绿色荧光的2种CdSe/CdS核壳型量子点，并用该量子点与鼠抗人的CD3抗体连接，制备得到CdSe/CdS⁃CD3复合物。用该复合物作为探针对人血淋巴细胞进行标记和成像，同时以异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的细胞为对照组。结果显示，FITC标记的细胞在20 min后荧光淬灭，而量子点标记的细胞连续激发30 min其荧光信号无衰减。众所周知，量子点中的镉离子Cd2+对细胞或组织会产生不同程度的毒性，因而其临床应用受到较大的限制［22⁃23］。Soenen等［24］为了克服这个问题，制备出无镉离子的量子点，ZnSe/ZnS量子点和InP/ZnS量子点，并探讨其对细胞生存能力、氧化性、细胞形态等的影响。与ZnSe/ZnS量子点相比，InP/ZnS量子点展现了更低的毒性，可以较长时间存在于活细胞中，因此无镉离子的量子点可以相对安全的用于细胞成像。

2.2.2 量子点的活体动物成像

量子点的活体成像的最终目的是进行体内研究及应用，以便未来能够用于临床的诊断及治疗。虽然目前量子点荧光成像应用成熟，但可见光对组织的穿透能力较弱，在实际应用中受到诸多限制。近年来有研究发现，采用红外光可以提高荧光在组织中的穿透能力，并且组织的背景荧光干扰也大大降低［25］。目前能够用于组织成像的近红外量子点产率都小于10%，但水相合成的CdHgTe/CdS量子点在发射波长790 nm的量子产率可达 20%［26］。Qian 等［26］将该量子点注射到小鼠右腿，通过活体荧光成像系统可以检测到注射的量子点荧光信号，该实验初步证实CdHgTe/CdS量子点作为荧光探针用于活体成像的可行性。

2.3 量子点其他应用

量子点除了上述提到的应用，也可用于刑事侦查的指纹显现等［27］、检测重金属离子如铅离子和铜离子等［28］。王玉珍等［29］制备了含量子点的叶酸靶向诊疗试剂，该试剂可以更好的对宫颈癌细胞进行诊断与治疗，为未来用于临床药物的靶向治疗提供可能。

3 展望

随着制备技术的发展，量子点在生命科学，特别是体外诊断方面的应用愈加广泛。但是如何制备出低毒的、产率高的水溶性量子点也是亟待解决的。前文已经提及量子点具有量子效应，可以制备出不同尺寸的量子点用于多元分析，这也是未来研究的一个重要方向。量子点与其他技术相结合同时检测多种标志物也将推动免疫学检测技术的发展，相信今后量子点的研究方向将更倾向于多元化、自动化、高通量，对各类疾病实现早发现早治疗。

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Progress in application of quantum dots as fluorescent probes

GUO Xinxin，Erxiati·Tuersun，HAN Zhenyu，LI Jinzhu，YANG Yan，LIU Tiancai★
（Institute of Antibody Engineering，School of Laboratory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

Quantum dots as a new type of fluorescent nano⁃materials have attracted wide attention because of their quantum effect,wide excitation spectrum and high molar extinction coefficient.In recent years,with the development of the preparative technology of water⁃soluble quantum dots,quantum dots have been widely used in biomedical researches.Here,the structure features of quantum dots,and biological imaging,vitro diagnostic and other aspects of the biological application in water⁃soluble quantum dots as the fluorescent probes were reviewed.The application of quantum magnetic beads in vitro diagnostic,quantum dots in the rapid diagnosis,double⁃tagging and chemiluminescence are also discussed.In addition,the application of high throughput,automation and diversification of quantum dots were evaluated.

Quantum dots;Biological application;Fluorescent probes;Vitro diagnostic

国家自然科学基金（21575058，81271931）；国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2014AA020904）

南方医科大学检验与生物技术学院抗体工程研究所，广东，广州510515

★通讯作者：刘天才，E⁃mail：liutc@smu.edu.cn