人巨细胞病毒核酸标准物质研制与应用

付岳 王瑞霞邹迎曙李尔华高旭年王军★

•述 评•

人巨细胞病毒核酸标准物质研制与应用

付岳1王瑞霞1邹迎曙1李尔华2高旭年2王军1★

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是威胁人类健康的最重要病原之一。随着分子生物学技术的发展，HCMV核酸水平的检测逐渐得到了广泛的认可，这也就需要研制HCMV核酸标准物质来保证检验数据的真实可靠。本文简要介绍了国内外目前存在的HCMV核酸标准物质的研制情况，并对这些标准物质在应用中遇到的问题进行了阐述，旨在为人巨细胞病毒核酸检测诊断试剂的标准化，以及为其质量控制提供参考。

人巨细胞病毒；核酸；标准物质

巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）属于β疱疹病毒亚科，病毒基因组大约235 kb。病毒感染具有严格的宿主特异性，例如人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）只能感染人［1］。HCMV感染在人群中很普遍但都无任何感染症状［2］。孕妇感染HCMV可引起新生儿宫内感染，导致胎儿畸形等严重疾患［3⁃4］。另外，在免疫功能低下的人群中，例如在艾滋病、器官移植病人中若感染 HCMV 将引起严重的并发症［5⁃6］。目前实验室检测HCMV感染的方法有病毒学检测、血清学检测与核酸检测等［7］。其中血清学的检测是应用最普遍的检测方法，但是由于血清学检测的局限性以及临床应用的需要，HCMV核酸检测逐步开始受到重视。然而最近有关HCMV检测的能力验证报告指出分子诊断缺乏重复性与可比性，究其原因主要是当前缺乏可用的国际标准物质［8］。在临床实验室检验中，采用可靠的标准物质是得到高质量检测数据的前提和保证，也是作出完整科学结论的基础。无论为体外诊断试剂制造商对产品进行量值溯源，还是实验室间的能力验证（室间质评），都离不开HCMV核酸标准物质。目前世界卫生组织（World Health Organization，WHO）、美国国家标准和技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）已经研制完成HCMV国际标准物质，国内也开展了相关的工作。本文对HCMV核酸标准物质的研制进展做简要概述，旨在为人巨细胞病毒核酸检测诊断试剂的标准化，以及为其质量控制提供参考。

1 HCMV核酸标准物质研制进展

1.1 WHO国际标准物质

目前WHO所研制的大部分核酸类国际标准物质都是用接近天然的生物材料制备而成。例如有些核酸类国际标准物质是将灭活的野生型病毒或者培养物稀释于人源阴性血清或通用稀释液，冻干后分装，按照WHO的固定程序对制备的候选标准物质进行稳定性和均匀性检验、多中心合作联合定值［9］。WHO制备的国际标准物质的表述单位通常为IU（international unit），这种标准物质量值是WHO经多中心联合定值后，确定其可以作为第一个国际标准物质后赋予的一个标准数值，后续标准物质的更替则以第一个标准值为标准继续定值。

2008年6月在英国国家生物制品鉴定所（the National Institute for Biological Standards and Con⁃trol，NIBSC）举行的基因扩增技术标准化临床诊断会议上讨论了关于HCMV标准品制剂的建议，对候选原材料和配方进行了讨论，并且最终确定候选标物是包含完整病毒颗粒的HCMV Merlin毒株（NIBSC code 09/162）［10］。Merlin 毒株为 gB1 基因型，与其它实验室常用HCMV毒株相比，该低传代株具有良好的HCMV的特征，包含近似于完整的HCMV基因组，且已完全测序（Gene bank登录号：AY446894）［11］。制备过程主要是将 HCMV Merlin毒株的培养上清样本在人胚肺成纤维细胞内增殖，收获培养上清液后先低速离心，然后超速离心收获病毒沉淀。考虑到用于HCMV检测样本来源的多样性，候选标准品被溶于通用的缓冲液，该缓冲液含有10 mmol/L的Tris⁃HCl和0.5%的人血清白蛋白，然后采用各自实验室所用的样本基质来进一步稀释。最后该制剂经过冷冻干燥以确保长期稳定。此标准品是通过来自14个国家的32个实验室进行联合定值，其中大多数实验室都采用实时荧光定量PCR法，最后其量值指定为5×106IU，并被推荐为首个针对HCMV的WHO国际标准物质，主要供临床医学实验室和体外诊断试剂制造商用于以核酸扩增技术为基础的二次引用HCMV校准试验［12］。

1.2 NIST国际标准物质

为了建立成分单一且稳定供应的国际标准物质，早在2002年即有专家在WHO会议上提出采用人工合成方法生产国际标准物质，随即开展了一系列相关研究［13］。其中NIST在HCMV人工合成国际标准物质的研发中取得了很大进展。

不同于HCMV⁃WHO国际标准物质，NIST研制的HCMV国际标准物质是经过提取纯化的HCMV基因组DNA。实验室用毒株在体外培养时常会产生基因序列缺失而导致假阴性检测结果，将目的基因连接于质粒中会保持基因组的稳定［14］。由于HCMV基因组大约235 kb，一般质粒载体无法连接，所以NIST研制的HCMV核酸标准物质（SRM2366）是将HCMV基因组通过同源重组方式插入到细菌人工染色体（bacterial artificialchro⁃mosome，BAC）上，以产生稳定基因组的克隆并且具有低传染性［15］。SRM2366所用毒株为Towne株，包含了除 IRS1、US1⁃15、和 UL147 以外相对完整的HCMV基因组。其制备过程主要是将构建好的HCMV Towne BAC转入EPI300大肠杆菌中，经过培养后收集菌体，再采用碱性裂解法提取纯化菌体释放的BAC DNA，最后将BAC DNA溶于Tris⁃EDTA（10 mmol/L Tris base，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）通用缓冲液中进行分装。此种制备方法可以持续获得稳定基因组的核酸标准品。SRM2366的定值不同于WHO采用实时荧光定量PCR的多中心协作定值，而是采用最新的数字PCR技术，此方法不需要线性标准品即可计算出待检DNA分子的拷贝数，而且实验中的探针和引物可以与荧光定量PCR通用。最后，制备的3个水平的HCMV标准品赋值分别为 420 copies/μL，2702 copies/μL，19641 copies/μL，并附有置信水平的不确定度［16］。

1.3 国内人巨细胞病毒标准物质、质控物

随着HCMV核酸检测技术在国内临床实验室的开展以及《临床基因扩增实验室工作规范》的施行，国内相关机构和临床检验实验室也在探索开发HCMV标准物质、质控物等。在临床检验中HCMV⁃DNA的定量检测主要通过尿液、血浆、乳汁等样本完成，并且由于尿液容易收集，标本阳性检出率较高，而其它标本阳性检出率较低［17］，所以目前国内一些临床实验室收集HCMV⁃DNA阳性的患者尿液样本再经过过滤制备成室内质控物［18］。目前国内实验室制备的室内质控物一般不添加任何防腐剂与稳定剂，这样可避免基质效应的不确定影响；并且研究也发现不加入稳定剂与向尿液室内质控物中加入稳定剂（牛血清白蛋白）无明显差别［19］。但是，此类质控物一般只能作为实验室内质控，无法像WHO或者NIST制备的HCMV核酸标准物质一样方便的进行更替换代以及量值溯源，在应用的过程中也就有所限制，对促进HCMV核酸检测标准化作用不大，所以国内也有些公司或机构研制了可溯源至WHO⁃HCMV国际标准物质的二级标准物质，主要用于校准仪器和装置、实验室质量控制等，在一定程度上解决了这个问题。

2 HCMV核酸标准物质的应用

目前，WHO等多个国际组织正在通过广泛应用国际参考物质，来证明其在核酸检测标准化过程中的实际应用价值。其中HCMV核酸国际标准品在其中起到了重要的作用。在实验室间的能力验证中，Rychert等［20］应用 WHO⁃HCMV 核酸标准物质来评价各参与实验室现行的HCMV核酸检测方法，结果显示WHO⁃HCMV核酸标准物质促进了HCMV检测的标准化并且各实验室数据具有可比性。HCMV核酸标准物质还应用于产品的溯源、仪器的评价和校准等。目前罗氏、雅培等体外诊断试剂制造厂商的校准品均溯源至WHO⁃HC⁃MV标准物质，并显示了良好的一致性，不过各检测系统的灵敏度仍然具有差异［21］。Tsai等［22］也应用WHO⁃HCMV标准物质来对不同HCMV核酸检测系统的性能特征、相关性和工作流程等进行评价。而且随着数字PCR技术的应用，为了评价荧光定量PCR和数字PCR等不同平台在核酸定量检测中的性能，Pavšič等［23⁃24］分别应用 WHO 和 NIST研制的2种核酸标准物质进行试验，结果表明数字PCR受到不同组成的PCR反应组分所产生的影响更小，并且在检测临床血浆样本中HCMV时，发现当病毒DNA载量≥4 log10时数字PCR的精密度明显高于荧光定量PCR的精密度。

在HCMV核酸以及其它核酸标准物质的广泛应用的过程中也出现了一些问题，例如，核酸提取效率的问题。例如，WHO和NIST研制的HCMV核酸国际标准物质制备方法不同，SRM2366国际标准物质为人工构建具有基本完整的病毒基因组，并且低传染性，但类似于此类的合成的核酸未参与核酸提取过程，故不能反映病毒核酸的提取效率；同时，国际参考物质在于提供一个准确的数值，而不是关注提取效率，因此在制备国际参考物质的时候是否需要考虑提取过程还有待讨论。另外，HCMV核酸标准物质的互换性也需要注意。互换性为不同检测系统对某个参考物质和来自健康或疾病个体代表样品的检测所得的结果量值一致，即各个样品或参考物质的检测值可以在不同检测系统间互换［25］。例如，Hayden 等［26］在研究HCMV核酸标准物质的互换性时发现，通过8家实验室采用10种不同的荧光定量PCR检测WHO⁃HCMV标准物质与50份临床样本，通过线性回归和对应分析WHO⁃HCMV标准物质的互换性，发现在此分析方法下WHO⁃HCMV标准物质互换性较差。并且HCMV核酸国际标准物质在不同基质中也会有影响，Jones等［27］研究表明使用全血稀释WHO⁃HCMV标准物质时会产生基质效应，全血稀释的WHO⁃HCMV标准物质进行HCMV全血定量测定校正试验时，样本的测量浓度值会偏高。然而使用血浆或通用缓冲液对标准物质进行稀释时无基质效应出现；而SRM2366国际标准物质，虽然不需要对其进行提取，但是在实验中采用血浆或者全血作为稀释液进行稀释后，于临床样本一同进行测量结果显示互通性良好。

小结

随着HCMV相关疾病研究的深入，HCMV的危害越来越受到重视。与其它方法相比，核酸水平的检测更为简便、可靠，并且可以做到早期检测及量化，对判断HCMV的活动性和评价抗病毒治疗疗效的动态监测有着重要的意义。而相应国际标准品建立工作也在不断推进，已存在的WHO和NIST的HCMV核酸标准物质在一定程度上促进了HCMV检测以及核酸检测的标准化。当然，在推动HCMV核酸检测的标准化中也遇到了很多问题，例如上文中提到的核酸提取效率问题，所以更需要推动核酸检测的全自动化以减少手动提取核酸的误差。并且目前国内市场上存在着大约10家HCMV核酸诊断试剂生产厂家，由于国内还缺乏可靠的HCMV核酸标准物质，所以大部分市售的HCMV核酸检测试剂的标准化还存在问题，这也就更需要相关机构去努力研制出可靠的HCMV核酸标准物质以促进核酸检测的标准化，为临床准确诊断提供合理依据。

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The development and application of reference materials for human cytomegalo⁃virus nucleic acids

FU Yue1,WANG Ruixia1,ZOU Yingshu1,LI Erhua2,GAO Xunian2,WANG Jun1★
(1.Beijing Key Laboratory of Medical Device Testing and Safety Evaluation,Beijing Institute of Medical Device Testing,Beijing,China,101111;2.Guangzhou Bangdesheng Biological Technology Co.,Ltd,Guangzhou,Guangdong,China,510665)

Human cytomegalovirus(HCMV)is one of the most important pathogens which are threatening people health in the world.With the development of molecular biology techniques,value of HCMV DNA detection has been recognized gradually.The reference materials for HCMV test are critical to guarantee the quality of the test.In this study,the research progress of the reference materials for HCMV nucleic acid amplification testing and the problems in application will be summarized.The aim of this study was to standardize the diagnostic reagents for human cytomegalovirus nucleic acid testing and provide a reference for the quality control.

Human cytomegalovirus;Nucleic acid;Reference materials

北京市科技计划课题（Z151100002115047）

1.北京市医疗器械检验所，医疗器械检验与安全性评价北京市重点实验室，北京101111

2.广州邦德盛生物科技有限公司，广东，广州510665

★通讯作者：王军，E⁃mail：wangjun1@bimt.org.cn