多重PCR检测在多种常见肠道致病菌中的效果观察

丁 芹

甘肃省张掖市疾病预防控制中心 甘肃省张掖市 734000

多重PCR检测在多种常见肠道致病菌中的效果观察

丁 芹

甘肃省张掖市疾病预防控制中心 甘肃省张掖市 734000

目的：探讨多重PCR检测在多种常见肠道致病菌中的应用效果。方法：取四种常见的肠道致病菌作为研究对象，包括：大肠杆菌O157、副溶血性孤菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌等，采用多重PCR法对四种肠道致病菌进行检测，并与临床模拟样品进行验证，分析多重PCR检测在多种常见肠道致病菌中的应用效果。结果：单重PCR结果显示：对于变形杆菌扩增出大小为522bp的特异性片段；单核细胞增生李斯特菌扩增出大小为155bp的特异性片段；大肠杆菌O157扩增出大小为366bp的特异性片段；副溶血性孤菌扩增出大小为199bp的特异性片段。多重PCR结果测定显示：大肠杆菌O157、副溶血性孤菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌特异性表明只有该四种菌扩增出特异性条带，其他均为阴性；灵敏度结果显示：多重PCR测定菌落计数数量级为103CFU/mL。结论：将多重PCR技术用于多重常见肠道致病菌中效果理想，能快速、准确的筛查致病菌，为临床治疗提供依据。

多重PCR检测；肠道致病菌；应用效果

近年来，随着人们生活水平的不断提高，人们对于食品安全问题提出了更高的要求，而食源性致病菌是威胁食品安全的重要原因，包括：大肠杆菌O157、副溶血性孤菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌等[1]。传统的肠道致病菌采用生理、生化、血清型水平方法测定，这些方法虽然能帮助患者确诊，但是测定所需周期较长，耗时也相对较多，灵敏度受到限制。因此，需要建立一种快速、简单、灵敏度高的检测手段实现肠道致病菌的鉴别。文献报道显示：将多重PCR检测用于肠道致病菌中效果理想，能实现不同病原菌的检测，为临床疾病治疗提供依据和参考，但是该结论尚未得到进一步证实[2]。为了探讨多重PCR检测在多种常见肠道致病菌中的应用效果。取2015年1月-2016年9月医院四种肠道致病菌作为研究对象，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

菌种及来源。副溶血性孤菌、普通变形杆菌及蜡样芽胞杆菌均由北京兰博瑞公司提供；大肠杆菌O157、单核细胞增生李斯特菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等均由疾病预防控制中心提供。

1.2 仪器及试剂

试验中使用的仪器和试剂包括：DNA提取试剂盒、PCR试剂（北京全式金生物有限公司）；营养琼脂培养基、血平板、溶菌肉汤液体培养基等（北京陆桥技术有限公司）；恒温培养箱、水浴箱（德国进口）；离心机、梯度PCR仪器（德国进口）。

1.3 方法

采用多重PCR法对四种肠道致病菌进行检测，并与临床模拟样品进行验证。（1）菌株培养及DNA培养。菌株培养过程中，将大肠杆菌及变形杆菌采用营养琼脂进行培养，37℃下培养，挑选出可用的3-5个菌种，将其接种在LB液体培养基中，完成DNA的提取。（2）引物的设计与合成。将四种肠道致病菌的基因序列进行提取，通过对比，筛选出不同的特异基因作为靶序列，根据靶序列形式设计出相应的引物。（3）单重PCR扩增及多重PCR建立。对大肠杆菌O157、副溶血性孤菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌四种致病菌进行单独扩增，呈现反应体系，其扩增条件在90℃预变性2.5min；90℃下变性30s，65℃退火30s，75℃延伸30s，连续进行36个循环，75℃下进行10min延伸。在单重PCR基础上建立多重PCR体系，根据电泳带的亮度确定最佳退火温度。（4）多重PCR检测。将所有的菌群放入同一反应体系中，实施多重PCR扩增。多重PCR反应灵敏性检测是将4种不同的肠道致病菌群进行24h培养，取出悬液，根进行梯度稀释，然后根据1:3:3比例提取DNA，根据优化后的多重体系进行反应，实施多重PCR检测[3]。

2 结果

2.1 单重PCR结果

单重PCR结果显示：对于变形杆菌扩增出大小为522bp的特异性片段；单核细胞增生李斯特菌扩增出大小为155bp的特异性片段；大肠杆菌O157扩增出大小为366bp的特异性片段；副溶血性孤菌扩增出大小为199bp的特异性片段。

2.2 多重PCR结果测定温度的设定

采用梯度PCR仪依次设定退火温度，PCR产物结果显示：64℃对应的条带最亮、最清晰，提示：64℃位最佳退火温度，见图1。

2.3 多重PCR结果测定灵敏度、特异度

多重PCR结果测定显示：大肠杆菌O157、副溶血性孤菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌特异性表明只有该四种菌扩增出特异性条带，其他均为阴性；灵敏度结果显示：多重PCR测定菌落计数数量级为103CFU/mL，见图2。

3 讨论

近年来，多重PCR技术在多重常见肠道致病菌中得到应用，且效果理想。多重PCR反应时在同一个反应体系中加入几种目的基因的引物，通过一次反应实现对多重目的基因的同时扩增。由于一个反应体系中不同的基因组之间、不同的引物之间会存在相互影响，必须对多重PCR体系进行重新优化，包括：反应中各个组分的浓度、退火温度等，通过PCR技术能测定肠道的病原菌类型，为临床治疗提供依据和参考。

综上所述，将多重PCR技术用于多重常见肠道致病菌中效果理想，能快速、准确的筛查致病菌，为临床治疗提供依据。

图1：多重PCR结果测定温度的设定

图2：多重PCR结果测定灵敏度

[1]傅翔.几种常见肠道致病菌多重PCR检测的效果评价[J].医学信息,2016,29(01):160-161.

[2]胡茂秀,王莎莎,俞超,等.鸡粪中沙门氏菌和大肠杆菌O78多重PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报,2016,38(01):58-62.

[3]燕雯雯,沈继录,李晓峰，等.多重实时PCR检测腹膜透析相关性腹膜炎致病菌的应用分析[J].安徽医科大学学报,2016,51(05):712-717.

丁芹，女，主管检验师。