发酵法制备D乳酸研究进展

李晓姝，高大成，王领民，张霖，樊亚超



发酵法制备D乳酸研究进展

李晓姝，高大成，王领民，张霖，樊亚超

（中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院，辽宁抚顺113001）

D乳酸作为一种重要的有机酸，在许多领域都得到了广泛应用，以D-乳酸为单体合成的聚乳酸材料因其优异的性能亦展现出良好的市场前景。而微生物发酵法合成D-乳酸在经济效益和环境效益等方面具有着显著的优势。综述了生物法制备D乳酸的最新进展，同时指出高产稳定菌株的获得以及与其性能适应的发酵工艺的开发，是提高发酵法D乳酸生产竞争力的关键所在。

D-乳酸；发酵；应用

乳酸在自然界中分布广泛，存在于多种植物、动物和微生物中，是生物体的常见代谢产物之一。乳酸是自然界中最小的手性分子，且常为DL混合型，是公认的三大有机酸之一。由于人和动物体内只含有L-乳酸脱氢酶，仅能对L-乳酸进行代谢，因此L-乳酸制备工业较早得以开发和发展。近年来，随着D-乳酸在农药、医药、化工等领域的广泛应用，D乳酸的开发开始受到广泛关注。

D乳酸的制备方法有化学拆分法、微生物酶法拆分和微生物发酵法[1,2]。化学法合成乳酸的途径通常有丙酸氯化水解法、乙醛氢氰酸法和丙烯-N2O4法等，得到的乳酸全部是外消旋DL-乳酸[3]。因此，通过化学合成法想要得到D-乳酸还需要进行一系列的化学拆分和分离步骤。其中，化学拆分时使用的拆分剂价格昂贵，同时后续的分离过程还存在难度大，毒性大，污染严重等问题。

微生物酶法拆分是利用脂肪酶选择性，可对酯类化合物的多种反应进行催化。当脂肪酶与混旋的乳酸酯反应时，脂肪酶可以选择性水解L-乳酸酯，而未被水解的D乳酸酯通过萃取和化学水解可以得到D-乳酸[4]。然而，该方法的工艺复杂，生产成本较高。相对地，微生物发酵法制备D-乳酸的生产成本较低，并能直接合成高光学纯度的D-乳酸，是工业上最具前景的生产方式。本文就近年来生物法合成D乳酸的研究进展进行了综述。

1 D-乳酸的应用及市场

1.1 D-乳酸在合成及化学领域的应用

D-乳酸可以作为多种手性物质的合成前体，也是重要的手性中间体及有机合成原料，在医药、农药、化妆品等许多化工领域的手性合成中有着广泛的应用[5]。D-乳酸是制备芳氧丙酸类除草剂的光学活性前体，芳氧丙酸类除草剂是最早实现产业化生产的一类旋光性除草剂，近年来在农业领域的应用越来越广[6]。以高光学纯度D-乳酸和甲醇酯化合成的D-乳酸甲酯可用来合成多种手性化合物，可作为重要的医药中间体[7]。

1.2 D-乳酸在聚乳酸材料方面的应用

聚乳酸作为一种生物基高分子材料，具有着诸多优良特性，其良好的耐热性、阻燃性和透明性，以及独特的生物相容性等，在许多领域都有广泛应用[8]。聚乳酸塑料以优异的生物可降解性、热塑性、安全性等而被公认为是取代传统塑料的理想材料之一。聚乳酸材料在生物医学领域可以用作疫苗佐剂、骨内固定物等。由于聚D-乳酸（PDLA）材料不被人体利用，只能被人体内微生物所分解，因此可以被用作药物缓释技术等[9]。

根据立体化学组成的不同，聚乳酸又分为聚左旋乳酸（PLLA）、聚右旋乳酸（PDLA）和聚消旋乳酸（PDLLA），三种聚合物的性能也不尽相同[10]。PLLA和PDLA具有结晶性，PDLLA是非晶性的。而聚乳酸材料结构中各异构体含量的不同，会导致材料降解速率、强度等性能的差异[11]。

1.3 D-乳酸的市场与生产现状

资料显示2014年全球乳酸市场约35~40万t，年增长率达10%。国内乳酸市场约7~8万 t，年出口量4~5万t。虽然目前的国内产能已超过传统乳酸市场的消化量，但许多新厂仍在建设[12]。2014年，山东金玉米引进中科院天津工业生物技术研究所乳酸技术，开始新建2 000 t规模的D-乳酸生产线[13]；绍兴新宁采用上海新立公司的技术筹建规模为2000 t的D-乳酸工厂。这些新建项目均以合成下游聚乳酸产品为目标，而获得高光学纯度的乳酸单体是聚乳酸聚合工业的前提要求。目前，大多数厂家采用发酵法制备L-乳酸（光学纯度96%~99%），而D-乳酸（光学纯度大于99%）只有普拉克及日本武蔵野能以工业规模提供市场。

近几年，随着高光学纯度D型及L型聚乳酸材料合成技术的突破以及材料在耐热、力学等多项性能上的提高，聚乳酸材料广受关注，应用领域已大为拓展。2014年，全球聚乳酸市场约11~12万t，且每年以20%~30%的增幅上涨。预计到2020年，全球聚乳酸市场可达30~50万t[12]。聚乳酸塑料在安全环保方面的优势是传统塑料无法比拟的，仅我国若能逐步限制传统一次性产品的生产使用，将会大大扩充国内的乳酸和聚乳酸市场容量。目前，全球聚乳酸主要由NatureWorks公司年产15万t规模的工厂供应。其他聚乳酸生产企业产量相较太小，成本价格受规模效应影响偏高，因而难以影响市场。中粮、普拉克、海正等公司，均计划新增产能，以满足聚乳酸市场需求[14]。

2 发酵法制备D乳酸的研究进展

2.1 微生物合成乳酸的发酵类型

微生物发酵生产D乳酸是利用糖类等物质作为碳源，加上氮源及其他营养元素，通过某些种类微生物来合成D乳酸。按照产D乳酸细菌的代谢途径及产物的不同，可将乳酸发酵分为三种类型，即：同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和混合酸型发酵。同型乳酸发酵是指经EMP途径生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶（LDH）作用下转化成乳酸，乳酸是葡萄糖的唯一代谢产物，但由于发酵过程中必然伴随着一系列的微生物生理活动，因此转化率无法达到理论上的100%[15]。异型乳酸发酵[16]是指发酵过程中葡萄糖代谢除生产乳酸外，还有CO2、乙醇等其他代谢产物。葡萄糖代谢合成乳酸的理论转化率不同菌种差别较大，但转化率均在60%以下。混合酸发酵[17]是同型发酵微生物在特殊情况下进行的一种发酵方式，当葡萄糖浓度受限、温度较低或pH 值改变，同型发酵的微生物则进行混合酸型发酵。混合酸发酵仍然经过EMP途径，但代谢途径发生改变，生成的代谢副产物以小分子有机酸为主。

2.2 D乳酸发酵菌种

2.2.1 D乳酸生产菌株的选育与改造

当前，国内外学者关注较多的D-乳酸生产菌种是芽孢乳杆菌属和乳杆菌属。这两类菌属的发酵同属于同型发酵，即以葡萄糖为碳源，经EMP途径生成丙酮酸，再由D-乳酸脱氢酶（LDH）作用下转化为D-乳酸。芽孢乳杆菌属和乳杆菌属的菌株还具有发酵所需能耗少，产物浓度高，适宜规模化发酵合成D-乳酸的特点。

丁子建等[18]采用微氧发酵芽孢乳杆菌（Sporola ctobacillus sp.），发酵72 h产物D-乳酸浓度达到41 g/L，葡萄糖转化率达到68%，产物光学纯度96%。付卫明[19]采用紫外线与硫酸二乙酯复合诱变S. inulinus BME126，D-乳酸产量相比出发菌株提高了45%。Xu等[20]通过氮离子束诱变了一株野生型芽孢乳杆菌，得到的突变株Sporolactoba cillus sp. Y2-8发酵，产物D-乳酸达到122 g/L，产量相比出发菌株提高了199%，葡萄糖摩尔转化率162%。郑辉杰[21]采用紫外线和硫酸二乙酯诱变结合pH梯度筛选，所选出发菌株为菊糖芽孢乳杆菌SP-BME126，筛选得到了遗传稳定性优良的菌株。

2.2.2 D乳酸生产菌株的基因工程构建

近年来，利用基因工程技术进行菌株改造得到了迅速的发展，基因构建技术定向性强，可对菌种进行定向构建。

大肠埃希菌是最常用的工程菌之一，为模式菌株，目前该菌株的基因组序列已经全部测出。常用于基因工程领域中基因克隆和载体构建。孟武等[22]克隆了大肠埃希菌E.coli W3110中4个代谢木糖关键基因：木糖异构酶基因（xylA）、木酮糖激酶基因（xylB）、转酮醇酶基因（tktA）和转醛醇酶基因（talA），并构建出含低氧启动子基因Pugb的加强型木糖表达载体，将该载体转化到E.coli W3110中，该菌株为甲酸乙醇基因缺失的突变株。构建组成型代谢木糖基因表达载体后，菌株W3110获得了代谢木糖合成D-乳酸的能力，E.coli W3110突变株中质粒的表达，强化了重组菌代谢木糖的能力，该菌株代谢木糖生成的D-乳酸光学纯度达99%以上，产量相比出发菌株提高了10%。胡媛等[23]利用枯草芽孢杆菌的基因组DNA作为模板，扩增得到葡萄糖脱氢酶基因（gdh），将其与表达载体pETduet-1连接，构建出pETduet-GDH。以粘质沙雷氏菌的基因组DNA为模板，扩增得到乳酸脱氢酶基因（ldh），与pETduet-GDH连接得到pETduet-LG，转化进入菌株E.coli BL21进行共表达。该重组大肠埃希菌可还原丙酮酸合成D-乳酸，底物的转化率可达86.5%，D-乳酸浓度17.3 g/L。

此外，研究人员亦开展了其他类型菌株的基因构建以生成D-乳酸。Okino等[24]先将谷氨酸棒杆菌的L-乳酸脱氢酶基因（L-ldh）敲除，再向该菌株中转入大肠埃希菌的D-乳酸脱氢酶基因，构建出具有合成D-乳酸能力的谷氨酸棒杆菌。利用该菌株发酵D-乳酸的产量达120 g/L，产物光学纯度大于99.9%。

2.3 发酵工艺

2.3.1 D乳酸发酵原料的选择

乳酸细菌合成D-乳酸的产量较高，但由于菌株自身合成氨基酸及B族维生素的能力较差[25]，生长所需的营养条件复杂，造成发酵成本较高，且不能有效利用木质纤维素基质和戊糖中的糖类。为了降低发酵成本，同时也为契合发酵原料不与人争粮的战略要求，研究者们开始了新型D-乳酸发酵原料的探索。

Calabia等[26]利用菌株L delbrueckii JCM 1148，分别以13%（w/v）蔗糖汁、13%（w/v）蔗糖蜜、10%（w/v）甜菜汁为原料，在pH 6.40条件下发酵72 h，D-乳酸的产量最高达到120 g/L，产物光学纯度最高达98.3%。Remedios等[27]选用菌株Lactobacillus coryniformis，以纤维素为底物发酵生产D-乳酸。发酵前先用纤维素酶水解原料纤维素，水解温度45 ℃，水解pH为4.8。在适宜的发酵条件，即温度在39 ℃，pH为6时，产物D-乳酸最高生产强度为1.32 g/L/h，得率为82%。文献[28]报道了以菌株Lactobacillus coryniformis ATCC 25600，采用废纸板为原料发酵合成D-乳酸，D-乳酸终产量为23.4 g/L。

2.3.2 新型发酵工艺

同步糖化发酵（SSF）是指糖化过程与发酵过程同时进行的发酵工艺，一方面可以避免过高的葡萄糖浓度对酶活和D-乳酸合成的抑制，另一方面可以提高设备利用率和缩短发酵周期。同步糖化发酵过程中使用的糖化酶种类主要取决于原料，这些水解酶包括纤维素酶、淀粉酶、菊粉酶等。姚日生等[29]考察了吐温80对稻草同步糖化发酵产乳酸中的作用。发现同等水解程度下，吐温80的加入可显著降低酶加量，将0.2 g/g的吐温80添加到酶用量10FPU/g体系时，水解120 h后的糖产率为292.2 mg/g，比未加吐温80的体系糖产率增加11%。叶志隆[30]使用餐厨垃圾进行同步糖化发酵生产乳酸，采用二阶响应面法对蛋白酶等的投入量进行分析，发现蛋白酶加量与乳酸产量呈显著正相关。Takaaki Tanaka等[31]考察了米糠为原料（浓度100 g/L），以菌株L.delbrueckii IFO 3202，同步糖化法发酵生产D-乳酸，发现当pH在6.0~6.8时会产生外消旋乳酸，控制体系的pH在5.0，发酵温度37 ℃，发酵36 h后产D-乳酸28 g/L，产物的光学纯度95%。

固定化发酵可重复利用菌体细胞，使得发酵过程在高细胞浓度下连续进行。专利[32]以纤维作为固定材料，将芽孢乳杆菌在固定化反应体系中发酵，菌体的固定化过程结束后，可进行多批次的反复发酵。产物乳酸浓度可达到140 g/L以上，生产强度最高达1.72 g/L/h，D-乳酸光学纯度为99.12%。原位分离技术（ISPR），可以通过将发酵体系中的代谢产物及时移除，降低高产物浓度对细菌生长和产物合成的抑制作用。Danner等[33]设计出了超滤膜生物反应器（MBR）与单极电渗析箱（ED）耦合的MBR-ED操作系统，采用可以利用戊糖和己糖的嗜热脂肪芽孢杆菌BS 119连续发酵合成乳酸。产物乳酸的终浓度达到115 g/L，运行1 052 h时测定，未发现有微生物污染，该操作系统可降低高BOD废水的排放，同时可降低能耗，具有很高的环境效益。

3 结论与展望

随着D-乳酸应用领域的不断拓广，尤其是以D-乳酸为原料的聚乳酸材料性能的不断提高和广泛应用，D-乳酸的合成越来越受到关注。生物法合成D-乳酸具有生产成本低，产品光学纯度高，合成路线绿色友好的特点，是最具前景的生产方式。高光学纯度D-乳酸产品的高效合成，很大程度上取决于生产菌种的性能。一直以来，研究者们对传统的乳酸发酵菌株开展了大量研究，由于菌种自身对于某些营养物质的合成缺陷，往往生产时的培养基组分复杂，对发酵成本的影响较大。近年来，随着基因工程科学的发展，基因工程育种技术开始吸引国内外学者的目光。利用基因工程技术可以对传统生产菌种进行改造，使其在转化率和底物耐受性等方面得到提高；同时应用于大肠杆菌及其他D-乳酸生产菌株的基因改造在某些方面也开始显现出优越性。由于产物在微生物机体中的合成是多步酶促反应协同作用的结果，因此，对于D-乳酸产生菌的改造应基于较为全面的菌种基因组序列信息，在多水平下，开展全面的代谢网络分析，以便实现高产菌株的定向、有效构建。

为了提高D-乳酸产率，学者们围绕D-乳酸生产过程开发了许多新的发酵技术，如同步糖化法、固定化发酵技术、连续化发酵和原位分离技术等。新型发酵技术的开发，对于提高设备利用效率，减少产物抑制，实现连续化发酵等具有着重要意义。D-乳酸的高效合成需要稳定高产的菌株，需要与菌种的性能和特性相适应的高效乳酸发酵工艺，同时还需开发出高效低能耗的分离提取工艺，才能在成本和产品纯度上使生物法D-乳酸生产更具有竞争性。

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Research Progress in Preparation of D-lactic Acid by Fermentation

（Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals，SINOPEC，Liaoning Fushun 113001，China）

As an important organic acid，D-lactic acid is widely used in a lot of fields. PLA materials which are synthesized from D-lactic acid also show good market prospects because of their excellent performance. Synthesizing D-lactic acid via the biological way has significant advantages, such as good economic benefit and good environmental benefit. In this paper, the latest development of biological production of D-lactic acid was introduced．It's pointed that obtaining high yield and stable strains and developing corresponding fermentation process is the key point to improve the competitiveness of D-lactic acid production by biological method.

D-lactic acid; Fermentation; Application

TQ 201

A

1671-0460（2017）08-1659-04

2017-04-14

李晓姝（1984-），女，辽宁抚顺人，工程师，硕士，2013年毕业于辽宁石油化工大学化学工程与技术专业，从事微生物化学品研发工作。E-mail：lixiaoshu.fshy@sinopec.com。