内生真菌与寄主互惠共生的分子机制

田沛，南志标(草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学草地农业科技学院,甘肃 兰州 730020)



内生真菌与寄主互惠共生的分子机制

田沛*，南志标
(草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学草地农业科技学院,甘肃 兰州 730020)

在自然界中广泛存在真菌与植物形成的共生体，这种共生作用可以引起真菌和其寄主植物发生重要的适应性变化。内生真菌与冷季型草坪草高羊茅和黑麦草形成互惠共生体，与病原真菌生长方式的不同，内生真菌仅在寄主细胞间生存，与寄主保持协同生长，这些独特的生长方式使得内生真菌生活在植物特定组织内，从不侵染植物细胞，因而寄主缺乏防御反应，二者通过信号交流和调控建立并维持这种互惠共生关系。内生真菌和寄主信号交流包括了多种已知的途径，其中确定的有活性氧调控途径，有丝分裂原活化蛋白(mitogen-activated protein，MAP) 激酶级联信号途径及cAMP和Ca2+作为第二信使的信号途径，本文综述了通过显微镜等各种技术确定的内生真菌在寄主细胞间的生长方式和目前通过基因敲除技术已知的与维持内生真菌与寄主互惠共生相关的基因，期望为深入揭示内生真菌与寄主的信号转导途径提供参考。

内生真菌；寄主；互惠共生；活性氧；信号途径

植物与微生物共生关系的形成使植物能适应陆地上不同的环境，其中研究最多的是植物与固氮细菌(rhizobia)、菌根真菌(mycorhizae)和内生真菌(endophyte)的共生关系[1-2]。禾草内生真菌指在禾草体内度过全部或大部分生活周期，而禾草本身不显示任何外部症状的一大类真菌[3]。广泛研究的内生真菌主要是子囊菌门(Ascomycota)麦角科(Clavicipitaceae)的有性世代Epichloё和其所对应无性世代Neotyphodium属内生真菌。由于该属内生真菌对家畜的毒性，近50年来国内外科学家已展开了一系列研究，包括内生真菌的分类学、系统学、协同进化、生物多样性、生态学和生物活性物质筛选等，以期深入了解内生真菌并去除其毒性，特别是分子生物学技术的应用，使内生真菌的检测、鉴定、遗传多样性等方面的研究获得了突破性进展[4-6]。内生真菌与禾草形成互惠共生体，内生真菌在寄主细胞间生存，从寄主获得糖类、氨基酸等营养以维持其生长，为了更好的生存，内生真菌合成生物碱提高共生体对环境适应性[7-8]，并同时提高寄主对生物胁迫和非生物胁迫的抗性[9-13]。植物与另外两种共生菌-固氮细菌和菌根真菌的共生机制及其寄主与真菌间的信号交流途径研究得较多，已经有了比较深入的了解[1,14]，但是由于对禾草内生真菌研究历史相对较短，其与寄主植物形成互惠共生体并进行信号交流和调控的机制还知之甚少。本文拟对目前国内外寄主植物与内生真菌之间，尤其是Epichloёfestucae-多年生黑麦草(Loliumperenne)共生体之间的信号传导及其调控功能等进行了综述，旨在为内生真菌如何与寄主形成共生机制提供有价值的参考，以期更好地利用内生真菌进行禾草育种。

1 内生真菌菌丝与寄主协同生长

内生真菌存在于植物组织内，与宿主建立复杂的相互作用，利用不同的方式进行传播。根据内生真菌的生活周期和对寄主的影响，将内生真菌分为3种类型。第1种类型，真菌在寄主体内度过大部分生活周期，但是当寄主开花时，真菌沿着花序生长并在其基部形成子座，子座产生的有性孢子借助昆虫、风和雨水进行水平传播。第2种，真菌在寄主少数分蘖上形成子座，其他分蘖仍然没有症状，内生真菌可以通过无症状分蘖产生的种子垂直传播给下一代，也可以通过子座产生的有性孢子进行水平传播。第3种类型，内生真菌在寄主外不产生任何症状，整个生活史中都不产生有子座的有性世代，仅依靠种子进行垂直传播。但是菌丝在寄主叶片上偶有分布，这些菌丝体产生分生孢子，使此类内生真菌仍然可能进行水平传播[15]。大多数内生真菌均属于这一类型[3,16-17]。因此本文后面描述的内生真菌均指第3种内生真菌。这种内生真菌菌丝体通常分布于宿主禾草叶鞘、茎秆、根状茎的细胞间隙,偶尔在宿主禾草叶片表面分布[18-20]。

图1 Epichloё 内生真菌与寄主共生时的关键特征[24,27]Fig.1 Key features of Epichloё symbioses with grasses a) EGFP表达菌株Epichloё festucae菌丝在种胚中分布(标尺=250 μm)；b)苯胺蓝染色后，E. festucae var. lolii 菌丝在黑麦草叶鞘中的分布，与长叶轴(虚线)平行排列[标尺(实线)=100 μm]；c)透射电子显微镜展示两条E. festucae var. lolii 菌丝在黑麦草叶鞘横切面的胞间分布 (标尺=1 μm)；d)内生真菌在叶片中生长的模式，在茎尖分生组织(SAM)和叶原基两个分生组织区(MZ)，顶端生长，随着叶片细胞成熟，他们在扩展区(EZ)尺寸持续增加，一旦叶组织成熟，生长停止；e)扫描电子显微镜展示了E. coenophiala菌丝(H)与寄主高羊茅细胞壁紧密连接(标尺=5 μm)；f)共聚焦显微镜展示了EGFP表达菌株E. festucae菌丝在生长的黑麦草叶片叶舌区(LZ)的分布，此区域有很多横向分支，红色是叶绿素自发荧光，叶片上两个黑色区域是维管束(标尺=100 μm)；g)EGFP表达菌株E. festucae菌丝在叶片基部扩展区25 mm处的共聚焦扫描电镜照片。箭头表示在菌丝间测量长度，两个平行菌丝表示在间隔190 min后拍照(标尺=100 μm)；h)根据共聚焦扫描电镜照片g描绘的菌丝生长图；i)绘图表示内生真菌菌丝(绿色)和寄主细胞(黄色)协同生长。当寄主细胞扩展时，内生真菌在胞间菌丝长度增加，横向菌丝随着菌丝扩展移动，分开更多。 a) Ryegrass embryo infected with hyphae of EGFP-expressing E. festucae strain Fl1 (Scale bar=250 μm); b) E. festucae var. lolii hyphae in a ryegrass leaf sheath. Hyphae, stained with aniline blue, are orientated parallel to the longitudinal leaf axis (dashed). Scale bar (solid)=100 μm; c) Transmission electron microscope (TEM) micrograph showing two E. festucae var. lolii hyphae in the intercellular spaces of a young ryegrass leaf blade (Scale bar=1 μm); d) Model illustrating successive stages in development of the grass leaf. Cells dividing in the meristematic zone (MZ) containing the shoot apical meristem (SAM) and leaf primordia displace older cells upward. As leaf cells mature they undergo a substantial increase in size in the expansion zone (EZ). Once fully expanded the leaf tissue is mature and growth ceases; e) Freeze-fracture Scanning Electron Microscope (SEM) micrograph showing a hypha; hyphae (H) of E. coenophiala in close contact with tall fescue leaf cells (Scale bar=5 μm); f) Confocal micrograph showing EGFP-expressing hyphae of E. festucae strain Fl1 in the ligular zone (LZ) of an elongating ryegrass leaf. Note the presence of many lateral branches in this region of the expanding leaf. The red pigment is autofluorescence of chlorophyll, the two dark regions in the blade are vascular bundles (Scale bar=100 μm); g) Confocal microscope images of E. festucae Fl1 25 mm above the leaf base in the expansion zone. The two parallel hyphae in the foreground were photographed twice at an interval of 190 min. Arrows indicate the lateral branches between which measurements were taken. Scale bar=100 μm; h) Schematic representation of the confocal images presented in (g); i) Diagrammatic representation of synchronised intercalary growth in host cells (yellow boxes) and endophyte compartments (green). As host cells expand, endophyte intercalary hyphal length increases, lateral branches move further apart and remain intact.

随着显微技术的发展，以Michael Christensen为首的科学家借助于光学、透射电子和扫描电子显微镜开展了大量的细微观测以阐明内生真菌在寄主体内的生长方式[21-28]，发现内生真菌仅在寄主细胞间生存，与寄主保持同步生长，菌丝有两种不同的生长模式，在分生组织区(包括茎尖分生组织区，叶片和叶鞘分化区三部分)，内生真菌通过顶端生长在叶原基和腋芽进行分化的细胞间形成浓密的菌丝网。在叶鞘和叶片部位，菌丝受寄主细胞机械拉伸，与寄主保持同步生长，当植物器官成熟，菌丝也停止生长。这种独一无二的生长方式可以分为3个阶段。第一阶段：胚乳内的内生真菌菌丝随着种子萌发在寄主分生组织扩繁，在细胞间进行顶端生长，在叶原基和腋芽部位生长并产生分支，在分生组织区形成菌丝网。第二阶段：内生真菌菌丝在叶鞘和叶片部位受严格控制，仅在寄主细胞外生长，菌丝在未知成分的胞外基质作用下紧紧粘附在寄主细胞壁上(图1)，从胞外质体空间中获得营养，随寄主组织生长而生长。菌丝与长叶轴平行，很少分支，偶然有垂直菌丝融合，使菌丝形成内部网络，促进细胞间信号和营养物质交换。菌丝在叶鞘部位与叶肉细胞壁紧密相连，在叶片部位与活细胞壁相连，菌丝构成叶片组织的一部分，植物细胞不受菌丝的任何影响，被粘附的细胞细胞质变得浓密，没有液泡，没有菌丝粘附的细胞有大液泡，说明内生真菌与寄主间发生了物质交换。当寄主细胞分化和扩展时，随着寄主细胞增大，粘附在细胞壁上的菌丝细胞得到拉伸(图1)。在植物生殖发育过程中，当花序原基从分蘖基部分生组织分化时，菌丝与花序同步生长，菌丝继续感染子房和花药，随着寄主的进一步生长和种子成熟，菌丝感染种子的盾片和珠心层，然后继续感染胚珠、心皮等,在胚形成以后，菌丝广泛分布在胚及周围包括胚芽尖、胚轴、糊粉层、胚乳和盾片，侵入叶原基和胚芽鞘原基,但不侵入根原基和胚根鞘原基。这些菌丝随着种子的萌发在新的植株中重复其第一、二阶段的生长。第三阶段：菌丝在寄主植物成熟细胞间停止生长，但是仍保持较高的代谢活性，产生生物碱。菌丝体数目不随叶片年龄增加而提高，但是菌丝的直径随叶片年龄增加而提高，细胞质成分变得复杂。比如在延伸叶片的叶基部以下，内生真菌细胞质相似且简单，包括核糖体，线粒体和细胞核。叶基部以上，由于代谢活动的持续，菌丝浓密缺少液泡，内生真菌细胞质比较复杂，多了脂质体、蛋白质晶体和管状体。这种协同生长的方式确保了内生真菌在寄主整个地上部分分布并不对寄主带来负面影响，并且完成垂直传播的过程。有时，E.festucae菌丝也在宿主禾草叶片表面无症状的分布，并不形成菌丝浓密的子座和香柱病[29-31]，这是内生真菌与叶片协同生长的过程中，内生真菌菌丝在叶片表皮细胞间生长时产生一种类似真菌附着胞的结构-expressorium，这种结构产生轻微压力使内生真菌菌丝从表皮细胞间穿透叶片角质层，在胞外生长，这些植物表面生长的菌丝仍与寄主体内精密分布的内生真菌菌丝相连，在叶片停止生长后菌丝也停止生长[32]。这些都说明了内生真菌与病原真菌生长方式的不同，这些独特的生长方式使得内生真菌生活在植物特定组织内，从不侵染植物细胞，因而寄主缺乏防御反应。已经确认内生真菌和寄主之间通过信号交流以启动和维持这种互惠共生关系，通过基因工程技术已经证实了多种信号途径参与控制菌丝的协同生长。

2 与维持内生真菌与寄主互惠共生相关的信号途径

随着生物学技术的发展，内生真菌与寄主保持互惠共生作用的分子机制是现在国际上关于内生真菌研究的热点[33-57]。Tanaka等[33]利用质粒和T-DNA插入突变技术筛选与寄主失去互惠共生关系的突变菌株，首次揭示了NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)氧化酶基因noxA的缺失使内生真菌失去与寄主互惠共生作用，从而发现了活性氧物质(reactive oxygen species，ROS)对维持互惠共生的关键作用。通过一系列正向和反向基因筛选，陆续发现了多种蛋白质或多肽在控制内生真菌生长和维持互惠共生中发挥关键作用。除了noxA基因，其他调控NADPH氧化酶复合体(Nox)活性的基因如noxR和racA，压力激活有丝分裂蛋白激酶(MAPK)-sakA基因，P21激活激酶pakA基因(表1)；进行钙离子通道调控的cnaA基因(表2)；CAMP信号通路基因acyA(表3);细胞完整性(CWI)MAPK激酶基因mkkA和mpkA等(表4)的缺失，都会导致内生真菌与寄主从互惠共生变为拮抗作用，表现为寄主矮化，细小分蘖增多，过早衰老，而内生真菌在共生体中生长不受限制，菌丝分支增多，不再与叶轴平行，维管束也被菌丝感染，真菌生物量显著提高(表1)，这种不受限制的生长模式与野生型菌株(WT)的限制型生长呈鲜明对照。初步推断以下4种信号通路对维持互惠共生的作用极其显著。

2.1 真菌NADPH氧化酶复合体(Nox)调控的ROS信号途径

NADPH氧化酶主要存在于哺乳动物嗜中性粒细胞、植物细胞和丝状真菌细胞中，以胞质NADPH为电子供体，催化细胞胞外O2生成超氧阴离子(O2-·)，是产生ROS的主要来源。这些ROS与胞外信号分子和细胞表面受体相互作用，参与cGMP相关、蛋白酪氨酸激酶相关和Ca2+相关途径等多种信号转导途径，对寄主防御反应和细胞分化具有重要的功能[34]。真菌Nox复合体有多个亚基以调控胞间合成活性氧ROS。ROS抑制内生真菌菌丝顶端生长，防止了菌丝在寄主分生组织叶片和腋芽原基处大量的扩增和在成熟叶片中的顶端生长。内生真菌Nox复合体基因(noxA,noxR,racA和bemA)缺失或突变都会使活性氧信号途径失去控制，因而导致寄主感病和矮化，菌丝无序生长，丧失互惠共生关系(表1)[33-36]，证明了Nox复合体在调控内生真菌与寄主互惠共生关系的重要作用。Nox复合体具有NoxA,NoxB和NoxC三个亚体(图2)，NoxA对维持互惠共生和抑制菌丝生长非常重要[34]，而NoxB对互惠共生关系影响不大(表1)，表明NoxA和NoxB亚基在内生真菌中具有不同的功能[33]。NoxA和NoxB亚基需要Nox调控亚基NoxR和GTP酶结合蛋白RacA的激活，RacA和NoxR通过质膜和内膜催化亚基与NoxA或NoxB形成多酶复合物，催化转换O2超氧(O2-)[33,35]；同时Nox复合体也需要极性蛋白BemA将其定位至内生真菌菌丝进行形态分化和生长的位点[37]。RacA受Cdc24和PAK调控，Cdc24可能是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)，PAK是P21活化激酶，PAK将抑制RacA的RhoGDI蛋白进行磷酸化，从而将RacA解离，解离后的RacA被GEF(Cdc24)激活，使GDP转化为GTP，从而发挥RacA对Nox复合体的调控作用(图2)。而有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路也可以调控Nox酶活性，编码压力激活MAPK的sakA基因的缺失也会导致互惠共生关系破坏，寄主矮化和早熟(表1)[31]，ROS含量增加，但是noxA和noxR基因表达不受影响，说明MAPK在转录后水平调控Nox复合体活性[38]。

2.2 钙离子(Ca2+)信号通路

Ca2+是细胞内普遍使用的信号转导因子，作为第二信使调控钙靶蛋白进行信号转导。Ca2+信号通路能够与ROS信号途径进行互作，很多ROS产生依赖于钙离子信号，Nox酶直接受钙信号调控[39]。ROS可能会激活钙离子通道，可能通过调节钙离子在胞质内外的流动影响钙离子信号通路[40]。钙调蛋白是一种钙离子应答蛋白，在真核细胞内普遍存在，其与钙离子结合形成活化的复合体，活化下游酶类，构成复杂的钙信号转导系统，从而启动基因表达与细胞生命活动[41]。激活钙调蛋白的激酶和磷酸酶是寄主与病原真菌反应中必不可少的[42]。内生真菌E.festucae菌株的cmkA，cmkB和cmkC基因编码多功能的钙调蛋白激酶，基因cnaA编码钙依赖蛋白磷酸酶(calcineurin)催化亚基，通过比较3个基因分别缺失的菌株与野生型菌株的表现，发现激活钙调蛋白的激酶cmkA，cmkB和cmkC基因的缺失并不影响内生真菌的ROS产量和与寄主建立互惠共生关系[43]。钙依赖蛋白磷酸酶进行各种蛋白的去磷酸化，参与多种受Ca2+信号转导途径，对维持内生真菌与寄主互惠共生作用至关重要，基因cnaA缺失严重破坏了互惠共生关系，寄主产生过敏致死反应(表2)[43]。虽然其他真菌的研究表明ROS信号途径与Ca2+信号通路能相互调控[44]，但是内生真菌中二者如何相互作用尚不确定。

图2 真菌Nox复合体激活途径的设想[34]Fig.2 A proposed scheme for the activation of fungal Nox complexes including NoxA and NoxB RacA和NoxR通过质膜和内膜催化亚基的NoxA或NoxB形成多酶复合物，催化转换O2超氧(O2-)。通过自我催化或细胞壁超氧化物歧化酶的催化，高活性的活性氧迅速转化为过氧化氢(H2O2)。活性氧有可能直接作用于真菌细胞壁，或直接作用于质膜受体或离子通道以激活内部信号通路。或者，膜溶性的过氧化氢首先穿过细胞膜然后激活信号转导通路。虚线框显示的通过与已知哺乳动物Nox比较，推测的Nox复合体调控者。适配器蛋白BemA，可能与哺乳动物p40phox蛋白具有相同功能，参与了p67phox同源物NoxR亚基的招募。p38 MAPK同源蛋白SakA通过亚基NoxR调控Nox复合体活性。 P21活化激酶(PAK)可能诱导RacA从抑制蛋白RhoGDI中解离。Rac随后被一个鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)激活导致GDP 转化为GTP。 RacA and NoxR form a multi-enzyme complex with the integral membrane catalytic subunit NoxA or NoxB which catalyses the conversion of O2 to superoxide (O2-). With spontaneous dismutation or a cell wall SOD (superoxide dismutase) catalytic activity, highly reactive ROS will be rapidly converted to hydrogen peroxide (H2O2). These ROS have the potential to activate internal signalling pathways by acting directly on the fungal cell wall or directly on the plasma membrane receptors or ion channels. Alternatively, the membrane-soluble H2O2 may first diffuse across the membrane, and then activate signalling pathways. The predicted regulators of the Nox complex are shown in dashed boxes. The adapter protein BemA, has similar function with p40phox protein in mammal, may be involved in the recruitment of the p67phox homologue, NoxR. The p38 MAPK homologue SakA may regulate the Nox complex via interaction with NoxR. A p21-activated kinase (PAK) may induce the dissociation of RacA from the inhibitor protein, RhoGDI. Rac is subsequently activated by a guanine nucleotide exchange factor (GEF) causing exchange of GDP for GTP.

2.3 cAMP信号通路

cAMP是一种普遍的信号通路，又称为PKA系统(蛋白激酶A系统，protein kinase A system)，是通过细胞外信号与相应受体结合，调节细胞内第二信使cAMP的水平变化，cAMP特异地活化cAMP依赖的蛋白激酶，使下游靶蛋白磷酸化，改变这些蛋白的活性，从而调节细胞功能。cAMP的水平变化主要靠腺苷酸环化酶(adenylate cyclase)[45]。该信号通路是真菌侵染寄主产生致病性必需的，而内生真菌E.festucae的腺苷酸环化酶基因(acyA, adenylate cyclase gene)的缺失破坏了cAMP级联反应，使菌丝生长从协同生长变得杂乱无序(表3)，表明cAMP级联反应也是维持互惠共生所必须[46]。

2.4 细胞壁完整性(cell-wall integrity，CWI)有丝分裂原活化蛋白(mitogen-activated protein，MAP)激酶(MAPK)级联信号途径

Ca2+梯度与特殊质膜钙离子通道激活与钙离子信号产生的机械压力有关，决定了内生真菌胞间扩展的位点。这样的调控机制需要细胞壁结构弹性的动态变化和细胞壁完整(cell-wall integrity，CWI)的(mitogen-activated protein，MAP)激酶(MAPK)信号途径。MAPK是存在于细胞信号转导途径中关键的蛋白激酶。MAPKKK(mitogen-activated protein kinase kinase kinase)-MAPKK (mitogen-activated protein kinase kinase)-MAPK (mitogen-activated protein kinase)组成的三酶级联反应调控MAPK的活性，MAPK的激酶(MAPPK)是一种双重特异蛋白激酶，能磷酸化其唯一底物MAPK使之激活，而激活的MAPK是蛋白激酶磷酸化级联反应中最重要的组分，该级联途径激活转录因子，从而调控下游一系列基因表达，产生对外界信号的响应[47-48]。CWI-MAPK途径通过调控细胞壁形成基因、细胞周期基因等基因的表达调控细胞壁的形态建成及介导细胞与外界环境之间的反应[49-50]。E.festucae菌株中的基因mkkA和mpkA分别编码CWI-MAPK途径中重要酶MkkA和MpkA，激活下游转录因子，从而诱导胁迫条件下细胞周期和细胞壁的变化。该途径通常与真菌菌丝融合，孢子产生，附着胞形成，感染植物和子实体形成等细胞发育阶段有关。而基因mkkA和mpkA缺失的E.festucae突变体菌株菌丝不能融合，产生一系列畸形结构，而与寄主共生时使共生体早衰死亡(表4)[51]，这些结果证明CWI-MAPK信号途径对维持互惠共生作用非常重要。

上述提到的4种信号通路分别或者协同启动细胞各种信号传递途径，构成一个复杂的信号网络系统。在后3种信号途径中，虽然Ca2+途径以Ca2+为第二信使，cAMP途径以cAMP为第二信使，而MAPK级联信号途径则以MAPKKK-MAPKK-MAPK三级激酶为模式，但是这3种信号途径最终都需要蛋白激酶和蛋白磷酸酶的催化作用调节下游靶蛋白活性，从而调节细胞活性和功能。但是这3种信号途径是否相互作用以及如何相互关联与ROS信号途径共同控制内生真菌与寄主的互惠共生仍然是需要值得深入研究的方向。

3 维持内生真菌与寄主互惠共生的胞间调控因子

除了上述4种信号途径，还有一些其他调控因子对维持互惠共生关系也是非常重要的(表5)。内生真菌仅在寄主胞间生存，并且内生真菌没有像其他真菌一样的吸器或者丛枝一样的结构从寄主获取营养，必须从质体外空间直接吸收营养或者通过菌丝与其粘附细胞进行营养转运。质体外空间条件及离子变化对内生真菌的生长至关重要。

3.1 胞外嗜铁素A调控铁离子平衡

铁离子是质体外空间中一种最关键的成分，是所有真核生物进行DNA合成和呼吸作用等一系列代谢反应必不可少的微量元素[58]。但是自由铁离子能调控产生具有细胞毒害作用的ROS，而微生物通过精密的铁离子吸收系统以获得自身所需铁离子，调控铁离子的稳态平衡。内生真菌利用铁通透酶介导的还原性铁吸收系统(reductive iron assimilation, RIA)或直接通过嗜铁蛋白进行铁离子吸收[5]。利用嗜铁蛋白进行铁离子吸收需要分泌嗜铁蛋白(可螯合三价铁离子的低分子量蛋白)。内生真菌产生两种不同功能的嗜铁蛋白-Epichloёnin A和铁色素型的铁菌素(ferricrocin)，在细胞间进行铁离子的贮存和转运，Epichloёnin A是具有独特结构的铁色素型嗜铁蛋白，在细胞内和细胞外同时存在，而铁菌素只在细胞内存在。非核糖体多肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetases，NRPS)是合成嗜铁蛋白的关键酶。而NRPS基因sidN编码的SidN合成Epichloёnin A，sidC编码的SidC合成铁菌素。sidN基因缺失的突变体导致与寄主共生关系由互惠性向拮抗性转换，是由于该菌株缺乏Epichloёnin A，破坏了铁离子的稳态平衡，过量的自由铁离子催化具有细胞毒性的ROS，寄主细胞中ROS水平升高，破坏了内生真菌与寄主的ROS调控途径，对寄主有害，寄主中与抑制铁离子相关基因显著上调。而sidC基因缺失菌株对共生关系则无影响，表明细胞内铁菌素对调控内生真菌铁离子平衡并不重要，而在细胞内和细胞外同时存在的嗜铁蛋白-Epichloёnin A对铁离子吸收和贮存以及维持互惠共生有重要作用[53]。

3.2 胞间pH调控

寄主质体外空间在调控植物细胞营养，离子平衡和激素水平等方面发挥着重要作用，胞间pH值变化受环境条件的调控会影响细胞功能[54]。内生真菌在胞间生存，必须能感应并响应胞间pH变化。而对已失去互惠共生关系的noxA，proA和sakA基因缺失菌株转录组研究发现感应pH变化的Pal通道中的锌指(zinc finger)蛋白转录因子PacC的调控基因pacC上调，表明PacC对维持互惠共生关系非常重要。但是pacC基因缺失菌株仅提高了菌株对盐胁迫的敏感，并不影响与寄主的互惠共生，而该基因过量表达的菌株在寄主中形成畸形卷曲的菌丝结构，菌丝多被破坏，而寄主分蘖数增多，说明pacC过量表达影响了内生真菌与寄主间信号通路，造成植物表型改变[54]。但是PacC如何维持胞质外pH，pH如何干扰内生真菌与寄主间信号通路有待于进一步研究。

3.3 菌丝胞间生长融合相关基因

菌丝结合或者营养菌丝的融合使菌丝间构建了完整的菌丝网。内生真菌在寄主细胞间协同生长构成菌丝网，其中菌丝融合相关基因soft(so)发挥了重要作用，E.festucae中so基因的缺失使该菌株菌丝不能结合，与寄主形成共生体时使寄主细胞变性、解体，进而造成寄主死亡[55]。而上述提到的使互惠共生关系丧失的noxA，noxR，proA基因缺失菌株也同时丧失了菌丝结合能力，这就说明了菌丝结合对互惠共生的维持具有重要作用。so基因的缺失并不引起菌丝过度增殖，但是对寄主生长更具破坏作用，这可能是so基因除了控制菌丝结合，在维持互惠共生中还具有非常重要的其他未知作用。

除了上述基因，还发现ezhB和clrD基因分别编码组蛋白H3K27和H3K9甲基转移酶，从而催化组蛋白H3K27和H3K9甲基化，参与异染色质形成及基因转录调控。proA基因编码锌指蛋白转录调控因子，调控esdC(编码肝糖原结合蛋白)和esdC基因的反方向转录基因EF320。这些基因缺失也造成互惠共生关系的丧失，说明在染色体水平调节内生真菌在寄主中基因转录的变化对维持互惠共生非常重要[56]。另外内生真菌在寄主细胞胞间生长还需要真菌进行细胞骨架的重组，包括微管和肌动蛋白丝的重组和囊泡转运重定向，而解释这些变化发生的分子和细胞机制仍是值得挑战的领域。

虽然利用转基因技术，已经对上述多个基因进行了研究，但是这些基因如何综合作用控制真菌与寄主的互惠共生关系，到底有多少信号途径参与了内生真菌与寄主间信号交流仍不确定。而基因组学的发展为全面评估内生真菌与寄主间基因变化提供了技术条件，比如Dupont等[59]利用高通量RNA测序技术比较E+和E-植株转录组的差异，发现内生真菌的感染E+植株有1/3以上的基因表达发生变化，这与寄主与病原真菌反应类似，其中一半基因是初级代谢产物，次生代谢物以及胁迫相关基因。初级代谢产物基因下调而次生代谢物基因上调，说明内生真菌感染改变了寄主植物代谢物合成，改变了植物的代谢进程，使更多底物向次生代谢物合成方向发生改变，以此为代价，寄主植物发育变缓。细胞壁合成受到影响，虽然细胞壁合成基因上调，但是寄主细胞壁变薄，而真菌菌丝粘附部位加厚。而胁迫相关基因表达发生不同程度的变化，比如抗旱相关基因下调，渗透调节物质基因和毛状体合成上调，说明内生真菌感染调控寄主通过渗透调节避旱，并增加毛状体和气孔闭合以维持湿度，通过这些方式增加寄主的抗旱能力。而利用类似方法比较noxA,proA和sakA基因缺失3个菌株和野生型菌株之间转录组的表达，发现3个突变菌株中有182个基因表达变化一致，说明E.festucae菌株这182个基因维系共生关系。这些基因与营养饥饿反应相关，包括编码降解酶类、转运蛋白、初级代谢产物等基因表达上调，而包括编码特定的小分子分泌蛋白和次生代谢相关酶类的相关基因表达下调。这些调控基因的变化说明失去互惠共生作用的突变体导致了寄主植物营养物质和细胞壁等降解，突变菌株从植物中获得大量的营养物质，向致病菌转化，由互惠共生转变为寄生关系[60]。但是从这些例子可以看出，内生真菌和寄主相互调控基因表达，发生变化的基因数目较多，阐明这些基因间的关联以及如何受到信号调控还是现在的难点。

4 展望

确定激活ROS表达和次生代谢物合成的信号转导途径以及进行信号转导的相关载体和植物代谢物，对更好地控制菌丝协同生长和调控次生代谢物的合成以维持内生真菌与寄主的互惠共生关系非常重要。内生真菌仅在植物细胞外存在，利用蛋白组学和基因组学仅比较E+和E-植株细胞外化合物的差异将有助于确定内生真菌与寄主信号途径中的化合物和蛋白。分析质体外蛋白质和代谢物将会更好地理解内生真菌的营养需求和细胞信号转导机制。比如通过比较E+和E-植株之间，细胞质和分泌成分之间蛋白组学的差异，发现了真菌Cu/Zn superoxide dismutase(SOD)可能保护内生真菌免受氧胁迫。而E+植株中较高含量的病原相关蛋白PR10则表明内生真菌激发寄主准备防御反应[61]。

内生真菌菌丝紧密黏合在植物细胞壁上与寄主进行营养和信号交流，真菌与寄主接触的质膜上的蛋白和化合物可能包含一系列响应植物信号的受体和转运体，利用转录组和代谢组学技术仅分析该部位的化合物将会更好地解释内生真菌与寄主之间的信号通路。同时，利用同位素示踪技术追踪内生真菌和寄主间的离子交换过程，将有助于解释二者信号交流如何调控代谢物的交换。

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Signaling in the mutualistic symbiotic interaction between endophytes and their hosts

TIAN Pei*, NAN Zhi-Biao

StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems,CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China

Symbioses between fungi and plants have occurred naturally and widely during long-term evolution. This relationship makes both fungi and plants more adaptable to environmental changes. Endophytes form symbiotic associations with temperate grasses includingFestucaandLoliumspp. The establishment and maintenance of these mutualistic associations involves mutual communication between the endophyte and the host. The growth of these endophytes is strictly intercellular and tightly regulated, and is synchronized with the growth of the host. Using this unique growth pattern, the endophyte does not trigger the host defense response and establishes a precise communication and regulatory pathway with the host. This communication will likely involve many well-known signaling pathways. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades and second messenger signaling pathways involving cAMP and calcium are the main pathways for signal transduction. Here, we review the endophyte growth pattern in the host, and discuss research on the genes involved in signaling pathways between the endophyte and host using modern molecular technologies. The information gained so far can be used to predict the possible functions of these pathways in endophyte associations, and provides a reference for further in-depth analyses of the communication network between the endophyte and the host.

endophyte; host; mutualistic; reactive oxygen species (ROS); signalling pathways

10.11686/cyxb2016176

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-04-21；改回日期：2016-06-07基金项目：国家基础研究发展规划“973”(2014CB138702)，国家自然科学基金项目(31502001)和中央高校基本科研业务费(lzujbky-2016-9)资助。作者简介：田沛(1979-)，女，河南新郑人，副教授，博士。E-mail: tianp@lzu.edu.cn*通信作者Corresponding author.

田沛, 南志标. 内生真菌与寄主互惠共生的分子机制. 草业学报, 2017, 26(4): 196-210.

TIAN Pei, NAN Zhi-Biao. Signaling in the mutualistic symbiotic interaction between endophytes and their hosts. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(4): 196-210.